Summary

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

Published: December 16, 2016
doi:

Summary

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Abstract

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

Introduction

Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso in cui le cellule staminali ematopoietiche (CSE) germogliano fuori endotelio hemogenic presente in una varietà di siti emopoietiche embrionali, come l'aorta-gonadi-Mesonefro e la placenta 1,2. L'incapacità di coltura in vitro CSE impedisce approfondita analisi di questo processo così come l'applicazione clinica di questi studi. Per aggirare questa limitazione, studi precedenti hanno tentato di derivare cellule staminali emopoietiche de novo sia attraverso la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) 3, o la plasticità indotta nelle cellule somatiche e la differenziazione diretto utilizzo di supporti riprogrammazione 4,5. Questi studi, tuttavia, non generano le cellule engraftable clinicamente sicuri o consentono lo studio di emopoiesi sviluppo definitivo "in un piatto."

Le cellule staminali pluripotenti Il lavoro romanzo stabilito da Yamanaka e colleghi di generare indotto (iPSCs) da fibroblasti somatica provides un quadro di fattore di trascrizione (TF) strategie basate iperespressione nella cella riprogrammazione destino 6,7. Questo lavoro ha spinto i ricercatori in diversi settori per generare tipi di cellule di scelta tramite TF riprogrammazione delle cellule somatiche facilmente ottenibili. L'obiettivo della strategia di riprogrammazione qui descritto è quello di indurre un processo hemogenic da cellule somatiche di topo usando un approccio riprogrammazione TF base con l'obiettivo di tradurre questi risultati per il sistema umano di riprogrammare fibroblasti paziente-specifici al fine di studiare ematopoiesi umana in vitro e generare prodotti sanguigni paziente-specifici per la modellazione della malattia, test anti-droga, e trapianto di cellule staminali.

Il primo passo per assicurare una corretta riprogrammazione in questo sistema il mouse è stato quello di sviluppare una linea giornalista che è servito come un read-out per l'espressione di CD34, un marker conosciuto in cellule progenitrici endoteliali e cellule staminali emopoietiche. Per fare questo, le linee di topo transgenico huCD34-AS e teto-H2BGFP sono stati usati per generate topo transgenico fibroblasti embrionali doppie (MEF), ora indicati 34 / H2BGFP, che fluorescenza verde dopo l'attivazione del promotore CD34 8. Questo ha permesso lo screening di una varietà di TF notoriamente richiesto in diversi punti durante specifica ematopoietico e sviluppo. Cominciando con 18 TF in PMX vettori retrovial (determinati attraverso la letteratura estrazione e profilatura di etichetta GFP trattenere HSC dalla descritto in precedenza 34 topi / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs state trasdotte con tutti i fattori e coltivati ​​su AFT024 HSC-portante cellule stromali. Dopo il riconoscimento di 34 / H2BGFP attivazione, TF sono stati successivamente rimossi dal cocktail riprogrammazione fino a quando è stato identificato il set ottimale di TF per l'attivazione giornalista. Dopo questa schermata iniziale, i fattori sono stati trasferiti in un sistema di inducibile vettore DOX pFUW per consentire l'espressione controllabile dei TF. Dal momento che questi due sistemi controllabili DOX sono incompatibili (le celle 34 / H2BGFP e vettori inducibili pFUW), MEF dasono stati necessari wild-type C57BL / 6 topi. E 'stato anche necessario fornire un microambiente appropriato per consentire hemogenesis di procedere e creare progenitori clonogeniche multilineage.

Gli studi attuali che tentano di riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) hanno incontrato vari livelli di successo 9-11. Ad oggi, la generazione di entrambi i mouse e HSPCs trapiantabili umani con a lungo termine e di auto-rinnovamento capacità ripopolamento non è stato raggiunto utilizzando lo stesso set di TF. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata della strategia precedentemente stabilito per indurre riproducibile hemogenesis in MEF. Abbiamo dimostrato che l'introduzione di un insieme minimo di TF (GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6) è in grado di istigare un programma di sviluppo complesso in vitro che fornisce una piattaforma con la quale emopoiesi sviluppo e applicazione clinica di riprogrammazione ematopoietiche possono essere studiate ulteriormente 12.

Protocol

dichiarazione etica: linee di cellule del mouse sono derivati ​​seguendo le linee guida per la cura degli animali della Scuola Icahn di Medicina presso il Monte Sinai, e dovrebbe essere fatto in conformità con qualsiasi istituto ospitante. 1. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Isolamento dei topi C57BL / 6 Impostare l'accoppiamento temporizzato 13. Una volta che un tappo vaginale viene visualizzato, prendere in considerazione questa Giornata 0.5. Separare le femmine col…

Representative Results

Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso che inizia in vari siti embrionali. Cellule endoteliali Hemogenic risiedono in questi siti e danno luogo a CSE tramite gemmazione delle cellule 23. Questo processo attualmente non può essere riprodotto mettendo CSE o precursori emopoietici nella cultura, che richiede una metodologia per ottenere in qualche modo queste cellule in vitro, sia per HSPC espansione ex vivo o la generazione de novo. Questo pro…

Discussion

Generazione HSPCs de novo da cellule somatiche facilmente raggiungibili offre un metodo unico per studiare ematopoiesi in vitro, e la possibilità di potenzialmente applicare questa tecnologia al sistema umano. Questa traduzione genererebbe un nuovo strumento per studiare la malattia ematologica umana in un piatto, oltre a fornire le piattaforme di prova della droga e gene targeting opportunità per il trattamento di numerose malattie con terapie nuove o trapianti di CSE. Nel campo, recenti studi hanno…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.

Materials

DMEM Invitrogen 11965-092
0.45uM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18G needles BD 305195
20G needles BD 305175
25G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65uM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Play Video

Cite This Article
Daniel, M. G., Pereira, C., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

View Video