Summary

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами

Published: November 11, 2016
doi:

Summary

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Abstract

Приемные передача ех естественных условиях расширил аутологичных опухоль-инфильтрации лимфоцитов (Tīls) могут опосредовать прочные и полные ответы в значительных группах пациентов с метастатической меланомой. Основными препятствиями такого подхода являются сниженная жизнеспособность переданных Т-клеток, вызванных укорочение теломер, и ограниченное число Tīls, полученных от пациентов. Менее дифференцированные Т-клеток с длинными теломерами бы идеальным Т-клеток подмножеством для приемному клеточной терапии Т, однако, генерировать большое количество этих менее дифференцированных Т-клеток является проблематичным. Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), что самообновлению, поддерживать плюрипотентности, имеют удлиненные теломеры, и обеспечивают неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Здесь мы приводим протокол для создания ИПСК с помощью вирусного вектора Сэндай для трансдукции факторов перепрограммирования в Tīls. Этот протокол генерацииS полностью перепрограммировать, вектор свободных клонов. Эти TIL-производные иПСК может быть в состоянии генерировать менее дифференцированные пациенто и опухоль-специфичные Т-клетки для клеточной терапии приемному Т.

Introduction

Клеточная технология перепрограммирования , что позволяет генерировать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью избыточной экспрессии определенного набора факторов транскрипции имеет большие перспективы в области клеточной терапии 1,2. Эти иПСК обладают транскрипционные и эпигенетические особенности и обладают способностью к самообновлению и плюрипотентности, подобно эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) 3-5. Примечателен прогресс в перепрограммирования технологии за последнее десятилетие позволило нам генерировать человеческие иПСК даже из терминально дифференцированных клеток, таких как Т – клетки 6-8. Т – клеточные производные иПСК (TiPSCs) сохраняют ту же переставить конфигурацию Т – клеточного рецептора (TCR) генов цепи как исходных Т – клеток, что позволяет регенерацию антиген-специфических Т – клеток из TiPSCs 9-11.

Почти 80% с меланомой инфильтрации лимфоцитов (Тилсом), полученные из опухоли пациента специфически распознавать опухолевый антигены, ассоциированные с Aй поддерживать цитотоксичность против первоначальных раковых клеток 12. Следует отметить, что было установлено , что экспрессия смерти запрограммированным клеток белок-1 (ПД-1) на Тилсом для идентификации аутологичных опухоле-реактивных репертуар, в том числе мутантным неоантигена-специфических CD8 + лимфоциты 13. Адаптивная передача экс-виво расширенных аутологичных Тилсом в сочетании с препаративных режимами lymphodepleting и системного введения интерлейкин-2 (IL-2) , может привести к существенной регрессии метастатической меланомой в группах пациентов 14. Несмотря на обнадеживающие результаты в доклинических моделях и у пациентов, плохое выживание вливали Т-клеток и наличие иммуносупрессивной путей, по всей видимости поставить под угрозу весь потенциал приемному клеточной терапии Т. Текущие клинические протоколы требуют больших ех естественных условиях манипулирование аутологичных Т – клеток, чтобы получить большое количество. Это приводит к образованию терминально дифференцированных Т-клеток, которые имеют плохую выживаемость, снижение Proliferative потенциала, а также высокие уровни PD-1 15.

Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью ИПСК, которые могут обеспечить неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Недавно мы сообщали о перепрограммирование меланомой Tīls , выражающую высокие уровни PD-1 от вируса Сендай (SeV) опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус 16. В то время как ретровирус векторы требуют интеграции в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммировать, SEV векторы неинтегрирующих и в конечном счете исключены из цитоплазмы. Перепрограммирование эффективность значительно выше , с системой SeV по сравнению с лентивирусов или ретровирусов векторами 6-8. Кроме того, SEV может специфически перепрограммировать Т – клеток в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), в то время как некоторые Ipsc клоны , порожденные лентивирусов или ретровирусов векторы могут быть из нелимфоидных родословных 6-8. Здесь мы подробнопроцедуры реализованы для выделения и активации меланомы человека Тилсом и для генерации TIL-производных ИПСК с использованием системы перепрограммирования SEV.

Protocol

Примечание: Пациенты должны дать информированное согласие на участие в Совете по институциональному обзору и человека плюрипотентных стволовых комитет Cell одобрено исследование. 1. Выделение и культура Tīls Получить материал опухоли, которая не требуется для гисто…

Representative Results

На рисунке 1 показан обзор процедуры , которая включает первоначальное расширение меланома Тилсом с рИЛ-2, который с последующей активацией анти-CD3 / CD28 и переноса гена Oct3 / 4, Klf4, Sox2 и с-Мус в Тилсом для генерации ИПСК. Как правило, Tīls по культуре с чрИЛ-2 начинают ф…

Discussion

Здесь мы показали протокол для перепрограммирования меланомы Tīls к ИПСК по SeV-опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Такой подход, с помощью системы SEV перепрограммировать Т – клетки, дает преимущество не встраивается метода 7.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

Materials

gentle MACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentle MACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929
RPMI 1640 Life technologies 11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer BD 352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes BD 352070
IMDM Life technologies 12440053
human AB serum Life technologies 34005100
L-glutamine (200mM) Life technologies 25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) Life technologies 21985-023
Penicillin-Streptomycin  Life technologies 15140-122
gentamicin Life technologies 15750-060
Ficoll-Paque PLUS GE 17-1440-02
D-PBS (-) Life technologies 14040-133
recombinant human (rh) IL-2 Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 BD 555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 BD 555725
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
FBS Gibco 26140-079
HEPES Life technologies 15630-080
N-Acetylcysteine Cumberland Pharmaceuticals Inc. NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well) Corning 353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well) Corning 353047
Sendai virus vector DNAVEC
SNL feeder cells Cell Biolabs, Inc CBA-316
mitomycin C SIGMA M4287 soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin SIGMA G1890
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 warm in 37 ℃ water bath before use
basic fibroblast growth factor (bFGF) Life technologies PHG0264
ReproStem Reprocell RCHEMD005 warm in 37 ℃ water bath before use

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
  4. Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
  5. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  6. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  7. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  8. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  9. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
  10. Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
  11. Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
  12. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
  13. Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
  14. Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
  15. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
  16. Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
  17. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  18. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
  19. Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).

Play Video

Cite This Article
Saito, H., Iwabuchi, K., Fusaki, N., Ito, F. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54375, doi:10.3791/54375 (2016).

View Video