बहुस्तरीय Alginate constructs: विषम सेल आबादी के सह संस्कृति के लिए एक मंच
Summary
Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.
Abstract
Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.
Introduction
इस तरह के जोड़ कार्टिलेज या intervertebral डिस्क के रूप में Compressive भार वहन ऊतकों विषम ऊतक क्षेत्रों है कि दोनों biomechanical समारोह और ऊतकों में उचित mechano पारगमन के लिए महत्वपूर्ण हैं से मिलकर बनता है। इतना ही नहीं सेलुलर संगठन है और अलग-अलग क्षेत्रों में अलग-अलग समारोह, लेकिन बाह्य matrices (ईसीएम) भी रचना और संगठन में विविध रहे हैं। उदाहरण के लिए, जोड़ कार्टिलेज अलग-अलग सेल आकृति विज्ञान, यांत्रिक समारोह, और ईसीएम के साथ तीन प्राथमिक क्षेत्रों के होते हैं। उनकी ईसीएम नेतृत्व भार वहन करने के लिए अंतर जिम्मेदारियों में मतभेद; सतही परत मुख्य रूप से लोड करने के लिए तन्यता प्रतिक्रिया में शामिल है, जबकि मध्यम और गहरी क्षेत्रों संपीड़न 1 के जवाब के लिए मुख्य रूप से जवाबदेह हैं। इसी तरह, intervertebral डिस्क, एक जेल की तरह नाभिक pulposus एक परतदार वलय फाइब्रोसिस से घिरा हुआ है और इन दो विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं biophysical उत्तेजनाओं के विभिन्न प्रकार के अनुभवके रूप में ऊतक से होकर गुजरती है और यांत्रिक बलों के लिए जवाब है 2। ऊतकों, कोशिकाओं और ऊतकों परतों के भीतर कोशिकी matrices के इन प्रकार में एक दूसरे के साथ बातचीत।
ऐसी विषम ऊतक संरचनाओं की संक्षिप्त ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है, और उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ को सीमित है। एक का निर्माण भीतर स्तरीकृत ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के सह संस्कृतियों का विश्लेषण करने के लिए प्लेटफार्म संवर्धन के लिए एक आवश्यकता है। जोड़ कार्टिलेज ऊतक इंजीनियरिंग में, पाड़-कम बहुस्तरीय निर्माणों इस ऊतक 3,4 की विभिन्न परतों नकल करने के लिए विविध ईसीएम जमा करने के लिए जोनल chondrocytes की क्षमता का दोहन करके निर्माण किया गया है। हालांकि, बहुस्तरीय हाइड्रोजेल निर्माणों सेल आबादी है कि स्वतंत्र रूप से एक मजबूत ऊतक के रूप में करने की क्षमता की कमी के विविध प्रकार की बातचीत की जांच के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न पॉपmesenchymal स्टेम कोशिकाओं की ulations बहुस्तरीय निर्माणों के भीतर सह सुसंस्कृत जा सकता है। इस तरह से बहुस्तरीय scaffolds दोनों chondrocytes और बेहतर ऊतक इंजीनियरिंग 5 के लिए mesenchymal स्टेम सेल फर्क के साथ इस्तेमाल किया गया है। इतना ही नहीं अलग सेल आबादी जा सह सुसंस्कृत कर सकते हैं समान हाइड्रोजेल परतों में है, लेकिन एक एकल कोशिका प्रकार का भी परतों है कि अलग-अलग कठोरता या जैव रासायनिक सामग्री कोशिकाओं 6.7 से अलग प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए चालाकी से किया गया है भीतर संवर्धित किया जा सकता।
कई अलग अलग biomaterial हाइड्रोजेल ऐसे पॉलीथीन ग्लाइकोल या पाली विनाइल शराब ठिकानों 7-9 का उपयोग उन लोगों के रूप में उपास्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सेल आबादी परत करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, alginate हाइड्रोजेल से सह संस्कृति में विषम सेल आबादी के अध्ययन के लिए बहुस्तरीय scaffolds बनाने के लिए सबसे सरल biomaterials में से एक हैं। agarose हाइड्रोजेल भी आसानी से बनते हैं, वहीं alginate हाइड्रोजेल की अनुमति के लिए आसान है का जोड़ा लाभ हैव्यक्ति की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए 3 डी निर्माण से कोशिकाओं की olation के रूप में पहले 10 में वर्णित किया गया है। पिछले अध्ययनों में, द्वि-स्तरीय alginate हाइड्रोजेल पतली शीट में गठन किया गया है और इन चादरों से, वर्गों कटा रहे थे (जैसे।, एक बायोप्सी पंच का उपयोग) इस तरह के जैव रासायनिक सामग्री या इंटरफेसियल कतरनी गुण 11,12 के विश्लेषण के लिए के रूप में विशेष अनुप्रयोगों के लिए। पतली शीट alginate के गठन के लिए एक अन्य तरीका कई परतों में स्तरीकरण के लिए क्षमता के साथ वर्णित किया गया है, लेकिन अभी भी यांत्रिक परीक्षण 13 में उपयोग के लिए हाइड्रोजेल करने के लिए परिवर्तन की आवश्यकता होगी।
यहाँ, हम reproducibly कोशिकाओं के सह संवर्धन विभिन्न आबादी में उपयोग के लिए द्वि-स्तरित alginate हाइड्रोजेल डिस्क बनाने के लिए एक तरीका मौजूद है। इस alginate डिस्क मंच के कई फायदे के पास। जाहिर है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आकार और छोटे आकार के एक बायोप्सी पु आवश्यकता के बिना एम्बेडेड कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना के लिए अनुकूल हैएनसीएच या कई अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल करने के लिए अन्य शारीरिक परिवर्तन। इसके अतिरिक्त, सेल व्यवहार्यता लेयरिंग प्रक्रिया के दौरान उच्च बनी हुई है, और जेल गठन के बाद जेल के भीतर दो सेल आबादी के एक स्पष्ट विभाजन कोई प्रारंभिक ओवरलैपिंग क्षेत्र के साथ दिख रहा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम इस तरह के physiologically बहुस्तरीय ऊतकों में उन लोगों के हैं, जैसे, उपास्थि के रूप में कई सेल आबादी के सह संस्कृतियों के अध्ययन के लिए बहुस्तरीय alginate हाइड्रोजेल डिस्क के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्ण?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).
Materials
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02um Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10um pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco Life Technologies | 25200 | Thaw in 37ᵒC water bath |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
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