الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة
Summary
Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.
Abstract
Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.
Introduction
الضغط الحاملة الأنسجة مثل الغضاريف المفصلية أو الأقراص الفقرية تتكون من مناطق الأنسجة غير المتجانسة التي تعتبر بالغة الأهمية لكلا ظيفة النشاط الحيوي ومناسبة والميكانيكية تنبيغ في الأنسجة. ليس فقط هو تنظيم الخلوية وظيفة متميزة في مختلف المناطق، ولكن تباينت مصفوفات خارج الخلية (ECM) أيضا في تكوين وتنظيم. على سبيل المثال، والغضروف المفصلي يتكون من ثلاث مناطق رئيسية مع اختلاف شكل الخلية، وظيفة الميكانيكية، وECM. الاختلافات في المبادرة ECM لالتفاضلية المسؤوليات الحاملة. وتشارك الطبقة السطحية في المقام الأول ردا الشد لتحميل، في حين أن المناطق الوسطى وعميقة مسؤولة أساسا للاستجابة لضغط 1. وبالمثل، في القرص الفقري، وحاصرت النواة اللبية هلامية من التليف رقائقي بالطوق والخلايا داخل هذه المناطق متميزة اثنين من تجربة أنواع مختلفة من المحفزات الطبيعية الحيوية2. في هذا النوع من الأنسجة والخلايا ومصفوفات خارج الخلية داخل طبقات الأنسجة تتفاعل مع بعضها البعض كما يخضع الأنسجة وتستجيب لقوى ميكانيكية.
تبقى خلاصة من هذه الهياكل الأنسجة غير المتجانسة تحديا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، وفهمنا من الأهمية البيولوجية محدودة. هناك حاجة لزراعة منصات لتحليل الأنسجة الطبقية وكذلك شارك في ثقافات مجموعات مختلفة من الخلايا في بناء واحد. في هندسة الأنسجة الغضروف المفصلي، تم تشييد بنيات-سقالة أقل الطبقات عن طريق تسخير قدرة غضروفية مناطقية لإيداع ECM متنوعة لتقليد طبقات مختلفة من هذا النسيج 3،4. ومع ذلك، توفر بنيات هيدروجيل الطبقات فرصة لتحقيق تفاعل الأنواع المختلفة للسكان الخلية التي تفتقر إلى القدرة على تكوين الأنسجة قوية بشكل مستقل. على سبيل المثال، والبوب مختلفةulations الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يشترك في تربيتها داخل بنيات الطبقات. وقد استخدمت هذه السقالات الطبقات مع كل غضروفية والتفريق الخلايا الجذعية الوسيطة لتحسين هندسة الأنسجة 5. لا يمكن إلا أن يكون شارك في تربيتها السكان مختلفة من الخلايا في طبقات هيدروجيل مماثلة، ولكن يمكن أيضا نوع وحيد الخلية يمكن تربيتها داخل الطبقات التي تم التلاعب بها لديك متفاوتة الصلابة أو المحتوى الكيميائي لانتزاع استجابات مختلفة من الخلايا 6،7.
وقد استخدمت العديد من الهلاميات المائية بيولوجية مختلفة لطبقة السكان الخلية لهندسة الأنسجة الغضروف مثل تلك التي تستخدم البولي ايثيلين جلايكول أو بولي فينيل الكحول قواعد 7-9. ومع ذلك، الهلاميات المائية الجينات هي واحدة من أبسط المواد الحيوية من خلالها إنشاء السقالات الطبقات لدراسة السكان الخلية غير متجانسة في الثقافة المشتركة. في حين شكلت أيضا الهلاميات المائية الاغاروز بسهولة، الهلاميات المائية الجينات لها فائدة إضافية تتمثل في السماح السهل هوolation من الخلايا من بناء 3-D لتحليل الخلايا الفردية كما وصفت سابقا 10. في دراسات سابقة، وقد تم تشكيل الهلاميات المائية الجينات ثنائية الطبقات في صفائح رقيقة ومن هذه الأوراق، وشرائح أقسام (على سبيل المثال، باستخدام لكمة خزعة) لتطبيقات معينة مثل لتحليل المحتوى الكيميائي أو خصائص القص بينية 11،12. وقد وصفت طريقة أخرى لتشكيل صفائح الجينات رقيقة مع إمكانية التقسيم إلى طبقات متعددة، ولكن لا يزال يتطلب تغيير في هيدروجيل لاستخدامها في اختبار الميكانيكية 13.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لخلق بتكاثر أقراص هيدروجيل الجينات ثنائية الطبقات لاستخدامها في زراعة-المشارك مجموعات مختلفة من الخلايا. هذه المنصة القرص الجينات تمتلك العديد من المزايا. في المقام الأول، وشكل استنساخه وحجم صغير يؤدى لالتحفيز الميكانيكي للخلايا جزءا لا يتجزأ من دون الحاجة إلى خزعة بوNCH أو غيرها من التغيير المادي للهيدروجيل للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال بقاء الخلية عالية أثناء عملية التصفيف، وبعد تشكيل هلام فصل واضح من السكان الخلية اثنين داخل هلام غير مرئية مع أي منطقة متداخلة الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول لتشكيل الطبقات أقراص هيدروجيل الجينات لدراسة شارك في ثقافات السكان الخلية متعددة، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبقات من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال، والغضروف. هياكل الطبقات، مثل منصة الثقافة وصفها، ويمكن استخدامها لدراسة التف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).
Materials
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02um Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10um pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco Life Technologies | 25200 | Thaw in 37ᵒC water bath |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
