古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定
Summary
ここでは、古典的なホジキンリンパ腫（HL）細胞から高品質、全exomeデータを生成するように設計された、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングと低入力、次世代ライブラリー構築プロトコルを説明します。
Abstract
古典的ホジキンリンパ腫のホジキンリード – スターンバーグ細胞は、炎症性リンパ球のバックグラウンド内にまばらに分布しており、典型的には腫瘍質量の1％未満を構成する。バルク腫瘍に由来する物質は、特徴付けに不十分な濃度で腫瘍含量を含む。したがって、8個の抗体を用いた蛍光活性化細胞選別、ならびに側方および前方散乱は、後の研究のために腫瘍から高純度のHRS細胞を迅速に分離および濃縮する方法としてここに記載されている。同時に、exomeシークエンシングの標準プロトコールでは、通常、フローソーティングでも高すぎることが多い100〜1,000 ngの入力DNAが必要であるため、高品質のライブラリー構築プロトコールを最適化して提供しますわずか10 ngの入力DNAからのデータ。この組み合わせは、全eのハイブリダイゼーション捕捉に適した次世代ライブラリーを作製することができるxome baitsまたはより集中したターゲットパネルを必要に応じて選択します。 HRS細胞のある種の配列決定は、健常な腫瘍内のT細胞またはB細胞と比較した場合、突然変異、挿入および欠失、およびコピー数の変化を含む体細胞変化を同定することができる。これらの知見は、HRS細胞の分子生物学を解明し、標的薬物治療の道筋を明らかにする可能性がある。
Introduction
次世代シークエンシングの結果としての癌ゲノミクスの進歩は、治療標的の同定および多くの血液学的および非血液学的新生物の予後診断において顕著なブレークスルーをもたらした。特定のゲノム改変に基づく新たな個別治療戦略は、多くの腫瘍型で急速に導入されている（参考文献1,2参照）。リンパ腫ゲノミクスの著しい進歩にもかかわらず、古典的ホジキンリンパ腫（CHL）における腫瘍性HRS細胞のゲノムは、過小発現していた。この研究は、反応性微小環境内の腫瘍性HRS細胞の不足により妨げられており、精製HRS細胞集団を単離することは困難である3 。
原発性腫瘍から生存可能なHRS細胞を単離するための方法は、Fromm et al。 図4に示すように 、この方法は、CD30、CD15、CD40、CD95、CD45 CD20、CD5およびCD64からなる8抗体カクテルを使用して、CHL腫瘍懸濁液からHRS細胞を明白に同定する。少なくとも10 7個の細胞（約10mgの組織）からなる腫瘍生検材料からの新鮮または凍結細胞懸濁液から少なくとも1,000個の生存可能なHRS細胞を単離することができる（フローサイトメトリー分析により90％以上であり、 10個の連続した症例のexomeゲノム分析によって少なくとも80％。
私たちは、フローサイトメトリーによる細胞単離技術を改良し、このプロセスを大幅に簡素化し、原発性CHL腫瘍から数千の生存可能なHRS細胞を迅速に単離することを可能にしました7 。本発明者らは、ホジキンリンパ腫の原発例における腫瘍細胞の最初の完全なエキソーム配列であると考えられるものを産生するためにこの技術を利用した。私たちの研究は、個々のCHL症例のゲノムワイドな高スループット研究の可能性を示しており、すでにCHL発症の側面を説明する可能性のある新規なゲノム改変の同定につながっている。
我々はさらに、ハイスループットゲノム研究のために抽出されたDNAを利用するためのパイプラインを開発した。 HRS細胞数が1,000個以下のHRS細胞からの信頼性の高い結果を得るために、アダプターライゲーション効率を高め、DNA断片ライブラリーを作製するための改変された次世代DNAライブラリー作製手順8を開発しました過度の増幅なしに。この方法は、ルーチンの臨床サンプルの分析と、再発性の突然変異および染色体の変化の検出を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術を習得した後のアプリケーションまたは方向
この研究により、少なくとも10ngのDNAを含むサンプルからのexomeシークエンシングが可能になります。臨床的な文脈において、この限界は、不十分な材料のために大部分の細針吸引試料を除外するが、適切な中核生検および切除生検試料を含む。これにより、可能なサンプルのより大きなセットからのデ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクト方法の開発は、Weill Cornell Medical Collegeの病理学および実験医学部門によって資金提供されました。私たちは、部分的な資金調達のために、計算生物学と医学の3つの機関のトレーニングプログラムを認めています。時間と知識を私たちと共有した科学者、特にMaryke Appelに感謝します。ダンバージェス; Iwanka Kozarewa;チャド・ロックリー; Jenny Zhang、Xiaobo（Shawn）Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson、Tuo Zhangを含むWeill Cornell Medical CollegeのGenomics Core Facilityの皆さんです。
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
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