Summary

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

Published: June 10, 2017
doi:

Summary

ここでは、古典的なホジキンリンパ腫(HL)細胞から高品質、全exomeデータを生成するように設計された、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングと低入力、次世代ライブラリー構築プロトコルを説明します。

Abstract

古典的ホジキンリンパ腫のホジキンリード – スターンバーグ細胞は、炎症性リンパ球のバックグラウンド内にまばらに分布しており、典型的には腫瘍質量の1%未満を構成する。バルク腫瘍に由来する物質は、特徴付けに不十分な濃度で腫瘍含量を含む。したがって、8個の抗体を用いた蛍光活性化細胞選別、ならびに側方および前方散乱は、後の研究のために腫瘍から高純度のHRS細胞を迅速に分離および濃縮する方法としてここに記載されている。同時に、exomeシークエンシングの標準プロトコールでは、通常、フローソーティングでも高すぎることが多い100〜1,000 ngの入力DNAが必要であるため、高品質のライブラリー構築プロトコールを最適化して提供しますわずか10 ngの入力DNAからのデータ。この組み合わせは、全eのハイブリダイゼーション捕捉に適した次世代ライブラリーを作製することができるxome baitsまたはより集中したターゲットパネルを必要に応じて選択します。 HRS細胞のある種の配列決定は、健常な腫瘍内のT細胞またはB細胞と比較した場合、突然変異、挿入および欠失、およびコピー数の変化を含む体細胞変化を同定することができる。これらの知見は、HRS細胞の分子生物学を解明し、標的薬物治療の道筋を明らかにする可能性がある。

Introduction

次世代シークエンシングの結果としての癌ゲノミクスの進歩は、治療標的の同定および多くの血液学的および非血液学的新生物の予後診断において顕著なブレークスルーをもたらした。特定のゲノム改変に基づく新たな個別治療戦略は、多くの腫瘍型で急速に導入されている(参考文献1,2参照)。リンパ腫ゲノミクスの著しい進歩にもかかわらず、古典的ホジキンリンパ腫(CHL)における腫瘍性HRS細胞のゲノムは、過小発現していた。この研究は、反応性微小環境内の腫瘍性HRS細胞の不足により妨げられており、精製HRS細胞集団を単離することは困難である3

原発性腫瘍から生存可能なHRS細胞を単離するための方法は、Fromm et al。 図4に示すように この方法は、CD30、CD15、CD40、CD95、CD45 CD20、CD5およびCD64からなる8抗体カクテルを使用して、CHL腫瘍懸濁液からHRS細胞を明白に同定する。少なくとも10 7個の細胞(約10mgの組織)からなる腫瘍生検材料からの新鮮または凍結細胞懸濁液から少なくとも1,000個の生存可能なHRS細胞を単離することができる(フローサイトメトリー分析により90%以上であり、 10個の連続した症例のexomeゲノム分析によって少なくとも80%。

私たちは、フローサイトメトリーによる細胞単離技術を改良し、このプロセスを大幅に簡素化し、原発性CHL腫瘍から数千の生存可能なHRS細胞を迅速に単離することを可能にしました7 。本発明者らは、ホジキンリンパ腫の原発例における腫瘍細胞の最初の完全なエキソーム配列であると考えられるものを産生するためにこの技術を利用した。私たちの研究は、個々のCHL症例のゲノムワイドな高スループット研究の可能性を示しており、すでにCHL発症の側面を説明する可能性のある新規なゲノム改変の同定につながっている。

我々はさらに、ハイスループットゲノム研究のために抽出されたDNAを利用するためのパイプラインを開発した。 HRS細胞数が1,000個以下のHRS細胞からの信頼性の高い結果を得るために、アダプターライゲーション効率を高め、DNA断片ライブラリーを作製するための改変された次世代DNAライブラリー作製手順8を開発しました過度の増幅なしに。この方法は、ルーチンの臨床サンプルの分析と、再発性の突然変異および染色体の変化の検出を可能にする。

Protocol

1.組織の処理と凍結リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはロズウェルパークメモリアルインスティチューション(RPMI)培地でリンパ節組織を収集し、収集24時間以内に処理する。摘出したリンパ節組織9を、2%ウシ胎仔血清(FCS)を含むRPMI 10mLを含むペトリ皿に移し、新鮮なメス刃で細かく切り刻む。組織をさらに粉砕/解離させるために、10mLシリンジプランジャーの?…

Representative Results

バイオアナライザープロットは、ライブラリー増幅および0.8xビーズクリーンアップの後に行う必要があります。所望の範囲内のフラグメントサイズの「通常のような」分布を見るはずです( 図2a )。曲線の目に見える「肩」のようなこの形状からの逸脱は、高分子量または低分子量の人工物の存在を示す。例えば、 図2b〜2d</stro…

Discussion

この技術を習得した後のアプリケーションまたは方向

この研究により、少なくとも10ngのDNAを含むサンプルからのexomeシークエンシングが可能になります。臨床的な文脈において、この限界は、不十分な材料のために大部分の細針吸引試料を除外するが、適切な中核生検および切除生検試料を含む。これにより、可能なサンプルのより大きなセットからのデ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクト方法の開発は、Weill Cornell Medical Collegeの病理学および実験医学部門によって資金提供されました。私たちは、部分的な資金調達のために、計算生物学と医学の3つの機関のトレーニングプログラムを認めています。時間と知識を私たちと共有した科学者、特にMaryke Appelに感謝します。ダンバージェス; Iwanka Kozarewa;チャド・ロックリー; Jenny Zhang、Xiaobo(Shawn)Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson、Tuo Zhangを含むWeill Cornell Medical CollegeのGenomics Core Facilityの皆さんです。

Materials

Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 ml syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 ml conical centrifuge tubes, force
Centrifuge capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68 Thermo-Fisher 24040-032
DNAase-I Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D4527-10KU store as 5mg/ml in RPMI in -200C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X))
CD64-FITC (22) Beckman Coulter, Miami, FL 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) Ebiosciences, San Diego, CA 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9) Beckman Coulter, Miami, FL 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98) BD Biosciences, San Jose, CA 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1) BD Biosciences, San Jose, CA Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2) Life Technologies, Grand Island, NY 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) Biolegend, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10) Serotec, Oxford, United Kingdom For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9) eBioscience, San Diego, CA For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23) Novus Biologicals, Littleton, CO For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads Beckman Coulter, Miami, FL Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers BD Biosciences, San Jose, CA any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard Promega A2360
10 mM Tris-Cl buffer NA
Qubit dsDNA HS Assay kit Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator Covaris, Woburn, MA Alternatives may be substituted
microTUBE Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK8221
Sybr Green Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9430
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0 Roche Nimblegen 6465684001
HiSeq Illumina
TruSeq-style Universal adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2 Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes BD Biosciences, San Jose, CA

References

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Cite This Article
Reichel, J. B., McCormick, J., Fromm, J. R., Elemento, O., Cesarman, E., Roshal, M. Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma. J. Vis. Exp. (124), e54399, doi:10.3791/54399 (2017).

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