Murino tendine flessore Lesioni e Chirurgia riparazione
Summary
tendini flessori della mano sono comunemente feriti, portando a mano la funzione compromessa. Tuttavia, la risposta di guarigione tessuto cicatriziale non è ben caratterizzato. Un modello murino di tendine flessore guarigione è dimostrata qui. Questo modello può migliorare la comprensione globale del processo di guarigione e valutare approcci terapeutici per migliorare la guarigione.
Abstract
Tendine collega muscolo scheletrico e ossa, facilitando il movimento di quasi tutto il corpo. Nella mano, tendini flessori (FTS) consentono la flessione delle dita e funzione generale mano. Lesioni ai FTS sono comuni, e la guarigione soddisfacente è spesso compromessa a causa di tessuto cicatriziale in eccesso e aderenze tra il tendine e il tessuto circostante. Tuttavia, poco si sa circa le componenti molecolari e cellulari del FT riparazione. A tal fine, un modello murino di FT di riparazione che riassume molti aspetti della guarigione negli esseri umani, tra cui gamma ridotta di movimento e una diminuzione delle proprietà meccaniche, è stato sviluppato e descritto in precedenza. Qui è prevista una dimostrazione approfondita di questa procedura chirurgica, che coinvolge transezione e successiva riparazione del tendine flessore lungo delle dita (FDL) nella zampa posteriore murino. Questa tecnica può essere utilizzata per condurre analisi lineage di tipi cellulari, valutare gli effetti di aumento di gene o perdita di funzione, e per testare l'efficacia di interventi farmacologici nel processo di guarigione. Tuttavia, ci sono due limitazioni principali per questo modello: i) il tendine FDL nella porzione centrale della zampa posteriore murino, dove la transezione e riparazione verificano, non è circondato da una guaina sinoviale. Pertanto questo modello non tiene conto per il potenziale contributo della guaina al processo di formazione della cicatrice. ii) per proteggere l'integrità del sito di riparazione, il FT viene rilasciata a livello della giunzione miotendinea, diminuendo le forze meccaniche del tendine, probabilmente contribuire ad una maggiore formazione di cicatrici. Isolamento di cellule sufficiente dal tessuto di granulazione del FT durante il processo di guarigione per analisi citofluorimetrica ha dimostrato impegnativo; citologia centrifugazione concentrare queste cellule è un metodo usato in alternativa, e permette di generazione di preparazioni di cellule in cui può essere eseguita l'etichettatura immunofluorescenza. Con questo metodo, la quantificazione di cellule o proteine di interesse durante FT guarigione diventa possibile.
Introduction
tendini flessori del lavoro manuale di concerto con i muscoli flessori dell'avambraccio e guaine digitali per consentire la flessione delle cifre e afferrando funzione della mano. tendini flessori corrono lungo il lato palmare della mano; questa posizione relativamente superficiale si traduce spesso in lesioni ai tendini flessori durante un trauma alla mano. I tendini guarire attraverso una risposta tessuto cicatriziale piuttosto che rigenerazione dei tessuti normali tendine 1. Mentre questo tessuto cicatriziale fornisce continuità al tendine, funzione viene drasticamente diminuita rispetto al tendine sano. Compositi tessuto tendineo-cicatrice sono caratterizzati da proprietà meccaniche deteriorate 1, rendendo i tendini riparati più probabilità di rottura. Inoltre, il tessuto cicatriziale manca l'organizzazione della struttura nativa fibre collagene tendine, causando un aumento della dimensione del tendine e bulk. Dati i vincoli anatomiche dell'unità tendine-guaina, anche un modesto aumento delle dimensioni del tendine può drasticamente rossouce la funzione scivolante del tendine, e quindi gamma cifre di movimento e funzione della mano.
Prima di lesioni del 1960 ai tendini flessori, in particolare quelli nella zona II della mano, non sono stati regolarmente riparato a causa delle gravi complicanze nella guarigione sorte con queste riparazioni 2. Questa zona della mano è stato indicato come 'terra di nessuno' 3. Tuttavia, i miglioramenti delle tecniche chirurgiche, i modelli di sutura e protocolli di riabilitazione di terapia fisica sono notevolmente migliorato i risultati del tendine flessore riparazioni 2. Nonostante questi progressi, fino al 40% delle riparazioni provocare la formazione di aderenze sufficiente a impedire la funzione della mano 4. Di conseguenza, un approccio biologico è necessario per migliorare la guarigione. Purtroppo, molto poco si sa circa il processo di guarigione del tendine a livello cellulare e molecolare. Così, l'obiettivo era quello di sviluppare un modello murino che potrebbe essere utilizzato per migliorare la understandin fondamentaleg dei componenti cellulari e molecolari del tendine flessore guarigione e la risposta formazione di cicatrici, come un mezzo per identificare nuovi bersagli terapeutici per migliorare la guarigione.
modelli animali più grandi hanno svolto un ruolo fondamentale nel favorire la comprensione del processo di guarigione del tendine flessore. Canine e coniglio studi hanno dimostrato sia la capacità di guarigione intrinseca ed estrinseca dei tendini flessori 5,6, l'importanza del movimento passivo anticipato controllato per minimizzare la formazione di aderenze relativa immobilizzazione 7, nonché gli effetti di diversi modelli di sutura sul processo di guarigione 8 , 9. Inoltre, il modello canino è stato utile in fase di test traslazionali approcci di ingegneria tissutale per migliorare la guarigione 10. Tuttavia, ci sono diversi importanti vantaggi nell'uso di un modello murino rispetto ad un grande modello animale, compreso il relativo costo, disponibilità di reagenti specifici murine, e la facilità di generare Knoc globalek-out o costrutti cancellazione / iperespressione tessuto-specifici. Inoltre, le somiglianze funzionali tra umano e topi rispetto ai tendini flessori 11 indicano la potenziale utilità nello sviluppo di un modello murino.
Sviluppo di un modello murino di tendine flessore transezione e riparazione imita molti aspetti della guarigione clinica, tra cui la formazione di abbondante tessuto cicatriziale e deteriorate proprietà meccaniche. Il modello qui descritto non è un vero ricapitolazione della pratica clinica a causa transezione del FDL all'incrocio miotendinea per proteggere il sito di riparazione. Inoltre, questo modello non tiene conto del contributo delle cellule sinoviali guaina alla risposta di guarigione, in quanto non vi è alcuna guaina sinoviale che copre la porzione centrale del tendine dove avviene la riparazione. Nonostante queste limitazioni, questo modello ha il vantaggio di gamma generatrice di aderenze movimento limitativo, che deve ancora essere dimostrata in modelli murini che più closely approssimare la situazione clinica. Questo modello è stato utilizzato per valutare knock-out modelli di topo 12,13, e per testare diversi approcci farmacologici per migliorare la guarigione 14-17. Istologica analisi di questo modello, utilizzando immunoistochimica e ibridazione in situ, in grado di fornire spunti importanti per la localizzazione dei geni chiave e proteine durante la guarigione. Tuttavia, l'istologia fornisce solo una analisi spaziale trasversale e non consente la quantificazione durante tutto il tessuto. Citometria a flusso rappresenta un approccio più quantitativo, ma solo un numero molto limitato di cellule può essere isolato dal tessuto guarigione tendine nel modello murino, e questo numero è ulteriormente diminuito durante fasi di fissazione, permeabilizzazione, e lavaggio. Prendendo questo in considerazione, citometria a flusso diventa un approccio impraticabile a causa del numero di animali che sarebbe necessaria. Un metodo alternativo è necessario per preservare la maggior parte di questa piccola popolazione di cellule in ordineper caratterizzare ulteriormente l'ambiente di guarigione. Il metodo utilizzato per ottenere questo, qui illustrato, coinvolge la concentrazione delle cellule isolate mediante citologia centrifugazione su un vetrino, seguito da immunocitochimica. Nel presente studio EdU (5-etinil-2'deoxyuridine, un analogo della timidina) l'inserimento e la successiva etichettatura è stato utilizzato per determinare lo stato proliferativo delle cellule relativa al luogo di guarigione. Questo approccio può essere applicato per testare l'efficacia dei trattamenti farmacologici sulla proliferazione cellulare, gene knock-out o sovraespressione, o per identificare e quantificare diverse popolazioni cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura chirurgica per un modello murino di completo transection e riparazione del flessore lungo delle dita tendine è presentato in questo studio. Inoltre è dimostrato una nuova applicazione di concentrare piccole popolazioni cellulari con citologia centrifuga, per consentire analisi immunocitochimica quantitativa dell'ambiente cellulare durante tendine flessore guarigione. Questo modello di riparazione tendine flessore dimostra una risposta di guarigione riproducibile, che può essere usato per valutare i c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dalla Società Americana di Chirurgia della Mano Pilot Award e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 30G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1X PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24x50mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
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