Murine Flexor seneskade og reparation kirurgi

Summary

Bøjesenerne i hånden er almindeligt såret, hvilket fører til nedsat håndfunktion. Imidlertid er arvæv healing svar ikke godt karakteriseret. En musemodel af flexor senen healing demonstreres her. Denne model kan forbedre den overordnede forståelse af helingsprocessen og vurdere terapeutiske metoder til at forbedre heling.

Abstract

Tendon forbinder skeletmuskulatur og knogler, lette bevægelse af næsten hele kroppen. I hånden, bøjesenerne (FTS) muliggøre fleksion af fingrene og generelle håndfunktion. Skader på FTS er fælles, og tilfredsstillende helbredelse er ofte forringet på grund af overskydende arvæv og sammenvoksninger mellem senen og omgivende væv. Men lidt om de molekylære og cellulære komponenter i FT reparation. Med henblik herpå en murin model for FT reparation, der rekapitulerer mange aspekter af heling hos mennesker, herunder nedsat vifte af bevægelse og nedsat mekaniske egenskaber, er blevet udviklet og beskrevet tidligere. Her en grundig demonstration af denne kirurgiske procedure er forudsat, der involverer overskæring og efterfølgende reparation af flexor digitorum longus (FDL) sene i murine bagpote. Denne teknik kan bruges til at foretage afstamning analyse af forskellige celletyper, vurdere virkningerne af gen-gevinst eller tab af funktion, og at teste effekticacy af farmakologiske indgreb i den helbredende proces. Der er dog to primære begrænsninger forbundet med denne model: i) FDL senen i midterdelen af ​​den murine bagpote, hvor overskæring og reparation forekommer, ikke er omgivet af en seneskeden. denne model er derfor ikke højde for den potentielle bidrag kappen til ardannelse processen. ii) For at beskytte integriteten af ​​reparationsstedet, er FT frigivet i myotendinous junction, begrænse den mekaniske kræfter senen, sandsynligvis bidrage til øget ardannelse. Isolering af tilstrækkelige celler fra granulationsvævet af FT under helingsprocessen for flowcytometrisk analyse har vist sig udfordrende; cytologi centrifugering for at koncentrere disse celler er en alternativ metode, der anvendes, og giver mulighed for generering af cellepræparater, hvor immunfluorescerende mærkning kan udføres. Med denne metode bliver kvantificering af celler eller proteiner af interesse under FT healing muligt.

Introduction

Flexor sener i hånden arbejde i koncert med flexor muskler i underarmen og digitale hylstre for at muliggøre bøjning af cifrene og gribe funktion af hånden. Bøjesenerne løber langs palmar aspekt af hånden; denne relativt overfladiske placering resulterer ofte i skader på flexor sener under traumer til hånden. Sener helbrede gennem en arvæv reaktion snarere end regenerering af normalt væv senen ^1. Mens dette arvæv giver kontinuitet til senen, er funktionen faldt dramatisk i forhold til sund sene. Tendon-arvæv kompositter er kendetegnet ved svækkede mekaniske egenskaber ^1, gør de reparerede sener mere tilbøjelige til at briste. Desuden mangler arvæv organiseringen af ​​det native senecollagen fiberstruktur, hvilket resulterer i en stigning i senen størrelse og bulk. I betragtning af de anatomiske begrænsninger af senen-skede enhed, selv en beskeden stigning i senen størrelse kan drastisk rødUCE den glidende funktion af senen, og derfor ciffer vifte af bevægelse og håndfunktion.

Forud for 1960'erne skader flexor sener, især dem i zone II af hånden, blev ikke rutinemæssigt repareres på grund af de alvorlige komplikationer i healing, der opstod med disse reparationer ^2. Dette område af hånden blev benævnt »ingenmandsland« ^3. Imidlertid har forbedringer i kirurgiske teknikker, sutur mønstre og fysisk terapi rehabilitering protokoller dramatisk forbedret resultater af flexor senen reparation ^2. På trods af disse fremskridt, op til 40% af reparationer resulterer i tilstrækkelig vedhæftning dannelse at hindre håndfunktion ^4. Derfor er en biologisk tilgang for at forbedre heling. Desværre, meget lidt er kendt om senen helingsprocessen ved cellulære og molekylære niveau. Således var målet at udvikle en murin model, der kunne bruges til at forbedre den grundlæggende understanding af de cellulære og molekylære bestanddele af flexor seneheling og ardannelse respons, som et middel til at identificere hidtil ukendte terapeutiske mål at forbedre heling.

Større dyremodeller har været medvirkende til at fremme forståelse af flexor senen helingsprocessen. Hunde og kaniner undersøgelser har vist både indre og ydre healing evne bøjesenerne ^5,6, betydningen af tidlig kontrolleret passiv bevægelse i minimering adhæsionsdannelse forhold til immobilisering ^7, samt virkningerne af forskellige sutur mønstre på helingsprocessen ^{8 9.} Desuden har hundemodellen været nyttigt i at teste translationelle vævsmanipulering strategier til forbedring healing ^10. Der er imidlertid flere væsentlige fordele ved at anvende en musemodel i forhold til en stor dyremodel, herunder de relative omkostninger, tilgængelighed af murine specifikke reagenser, og den lethed generere global knock-outs eller vævsspecifikke sletning / overekspression konstruktioner. Endvidere er de funktionelle ligheder mellem mennesker og mus med hensyn til bøjesenerne ¹¹ antyder potentiel anvendelighed i udviklingen af en murin model.

Udvikling af en musemodel af flexor senen overskæring og reparation efterligner mange aspekter af klinisk helbredelse, herunder dannelsen af ​​rigelige arvæv og forringede mekaniske egenskaber. Den her beskrevne model er ikke en sand sammenfatning af klinisk praksis på grund af overskæring af FDL på myotendinous krydset for at beskytte reparationsstedet. Endvidere hindrer model ikke højde for bidraget fra seneskede celler til den helbredende reaktion, da der ikke er seneskeden dækker midterdelen af ​​senen hvor reparationen forekommer. Trods disse begrænsninger, denne model har den fordel genererende vifte af bevægelse-begrænsende adhæsioner, der endnu ikke er påvist i murine modeller at flere Closely tilnærme den kliniske scenarium. Denne model er blevet anvendt til at vurdere knock-out musemodeller ^12,13, og at teste forskellige farmakologiske metoder til forbedring healing ^14-17. Histologiske analyser af denne model, ved hjælp af immunhistokemi og in situ hybridisering, kan tilvejebringe vigtig indsigt i til lokalisering af vigtige gener og proteiner under heling. Imidlertid histologi giver kun et tværsnit rumlig analyse og tillader ikke kvantificering hele væv. Flowcytometri repræsenterer en mere kvantitativ tilgang, men kun et meget begrænset antal celler kan isoleres fra den helbredende senen væv i musemodellen, og dette tal reduceres yderligere under fiksering, permeabilisering, og vasketrin. Tage dette i at konto, flowcytometri bliver en umulig tilgang på grund af antallet af dyr, der ville være påkrævet. En alternativ metode er nødvendig for at bevare de fleste af denne småcellet population med henblikTil yderligere karakterisering af milieu healing. Den anvendte metode til at opnå dette, er vist her, involverer koncentration af de isolerede celler via cytologi centrifugering på et objektglas, efterfulgt af immuncytokemi. I den foreliggende undersøgelse edu (5-ethynyl-2'-deoxyuridin, et thymidin-analog) inkorporering og efterfølgende mærkning blev anvendt til at bestemme den relative proliferativ tilstand af celler ved den helbredende site. Denne metode kan anvendes til at teste effektiviteten af ​​farmakologiske behandlinger på celleproliferation, gen knock-out eller overekspression, eller til at identificere og kvantificere forskellige cellepopulationer.

Protocol

Universitetet Komité for Dyrs Forskning ved University of Rochester godkendt alle dyreforsøg. Ti-12 uger gamle C57BL / 6J mus blev anvendt. 1. Forberedelse af dyr for Flexor sene kirurgi (~ 15 min) Autoklave kirurgiske instrumenter til at sterilisere, bære sterile handsker overalt, og opretholde en steril drift felt. Anesthetize mus via intraperitoneal injektion (ip) med et volumen af ​​ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) svarende til legemsvægt. Bekræf…

Representative Results

Flexor digitorum longus (FDL) muskel, beliggende i læggen, virker til at bøje cifrene i muse bagpote via flexor senen (skitseret i blåt i figur 1A, og vist histologisk i figur 2A), der løber proksimalt fra den myotendinous krydset og ender i de distale phalanges. I denne model af flexor senen healing er FDL senen transekteret og repareret på midten af foden, proksimalt til forgreningen på cifrene i bagpoten (røde pile, figur 1A). …

Discussion

Den kirurgiske procedure for en murin model for fuldstændig overskæring og reparation af flexor digitorum longus senen præsenteres i denne undersøgelse. Desuden en ny anvendelse af koncentrere små cellepopulationer med cytologi centrifuge er påvist, der giver mulighed for kvantitativ immunocytokemisk analyse af den cellulære miljø under flexor senen healing. Denne model af flexor senen reparation demonstrerer en reproducerbar helbredende reaktion, som kan anvendes til at vurdere ændringer i helingsprocessen ved…

Materials

Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1ml syringe	BD	309659
30G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1X PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24x50mm #1.5
Clear nail polish