Flexor murino Lesión del tendón y Cirugía de reparación

Summary

Los tendones flexores de la mano se lesionan con frecuencia, dando lugar a alteración de la función de la mano. Sin embargo, la respuesta de curación de la cicatriz de tejido no está bien caracterizado. Un modelo murino de la curación del tendón flexor se demuestra aquí. Este modelo se puede mejorar la comprensión global del proceso de curación y evaluar enfoques terapéuticos para mejorar la curación.

Abstract

Tendon conecta el músculo esquelético y el hueso, lo que facilita el movimiento de casi todo el cuerpo. En la mano, tendones flexores (FTS) permiten la flexión de los dedos y la función de la mano en general. Las lesiones en el FTS son comunes, y la curación satisfactoria a menudo se ven mermadas por el exceso de tejido cicatrizal y adherencias entre el tendón y el tejido circundante. Sin embargo, poco se sabe acerca de los componentes moleculares y celulares de la reparación FT. Para ello, un modelo murino de reparación FT que recapitula muchos aspectos de la cicatrización en seres humanos, incluyendo alteración de la amplitud de movimiento y la disminución de las propiedades mecánicas, se ha desarrollado y descrito previamente. A continuación se proporciona una demostración en profundidad de este procedimiento quirúrgico, que implica la transección y la posterior reparación del tendón flexor largo de los dedos (FDL) en la pata trasera murino. Esta técnica se puede utilizar para llevar a cabo el análisis de linaje de diferentes tipos de células, evaluar los efectos de la ganancia o pérdida de genes de función, y para probar la eficacia de las intervenciones farmacológicas en el proceso de curación. Sin embargo, hay dos limitaciones principales para este modelo: i) el tendón FDL en la porción media de la pata trasera murino, donde se producen la transección y reparación, no está rodeado por una vaina sinovial. Por lo tanto, este modelo no tiene en cuenta la contribución potencial de la funda para el proceso de formación de la cicatriz. ii) Para proteger la integridad de la zona de reparación, el FT es liberado en la unión miotendinosa, disminuyendo las fuerzas mecánicas del tendón, probablemente contribuyendo a un aumento de la formación de cicatrices. Aislamiento de células suficientes de tejido de granulación de la FT durante el proceso de curación para el análisis de citometría de flujo ha demostrado ser un desafío; centrifugación citología para concentrar estas células es un método alternativo utilizado, y permite la generación de preparaciones de células en el que puede llevarse a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia. Con este método, la cuantificación de células o proteínas de interés durante la curación FT se hace posible.

Introduction

Los tendones flexores de la mano de obra en concierto con los músculos flexores del antebrazo y vainas digitales para permitir la flexión de los dedos y agarrar la función de la mano. Los tendones flexores corren a lo largo de la cara palmar de la mano; esta ubicación relativamente superficial a menudo resulta en lesiones de los tendones flexores durante un traumatismo en la mano. Los tendones se curan a través de una respuesta del tejido de la cicatriz en lugar de la regeneración de tejido del tendón normal de ^1. Aunque este tejido cicatricial proporciona continuidad en el tendón, la función se reduce drásticamente con respecto al tendón sano. Materiales compuestos de tejido del tendón-cicatriz se caracterizan por propiedades mecánicas reducidas ^1, lo que hace que los tendones reparados más propensos a romperse. Además, el tejido de cicatriz carece de la organización de la estructura de fibra de colágeno de tendón nativo, dando como resultado un aumento en el tamaño del tendón y a granel. Dadas las limitaciones anatómicas de la unidad de tendón-vaina, incluso un modesto incremento en el tamaño tendón puede drásticamente rojoUCE la función de deslizamiento del tendón, y por lo tanto rango dígitos de movimiento y la función de la mano.

Antes de las lesiones del 1960 a los tendones flexores, en particular los de la Zona II de la mano, no fueron reparados de forma rutinaria debido a las graves complicaciones en la cicatrización que surgieron con estas reparaciones ^2. Esta zona de la mano se conoce como 'tierra de nadie' ^3. Sin embargo, las mejoras en las técnicas quirúrgicas, los patrones de sutura y los protocolos de rehabilitación de terapia física han mejorado dramáticamente los resultados de la reparación del tendón flexor ^2. A pesar de estos avances, hasta el 40% de las reparaciones resultado la formación de una adherencia suficiente para impedir la función de la mano ^4. Por lo tanto, se requiere un enfoque biológico para mejorar la cicatrización. Por desgracia, se sabe muy poco sobre el proceso de curación del tendón a nivel celular y molecular. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un modelo murino que se podría utilizar para mejorar la understandin fundamentalg de los componentes celulares y moleculares de la curación del tendón flexor y la respuesta la formación de cicatrices, como un medio para identificar nuevas dianas terapéuticas, para mejorar la curación.

modelos animales de mayor tamaño han sido fundamentales para fomentar la comprensión del proceso de curación del tendón flexor. Canina y de conejo estudios han demostrado tanto la capacidad de curación intrínseca y extrínseca de tendones flexores ^5,6, la importancia de movimiento pasivo controlado temprano en la minimización de la formación de adherencias con relación a la inmovilización ^7, así como los efectos de diferentes patrones de sutura en el proceso de curación ^{8 , 9.} Además, el modelo canino ha sido útil en el ensayo de enfoques de ingeniería de tejidos de la traducción para mejorar la cicatrización ^10. Sin embargo, hay varias ventajas importantes en el uso de un modelo murino con respecto a un modelo animal grande, incluyendo el costo relativo, la disponibilidad de reactivos específicos murinos, y la facilidad de generar KNOC mundialk-outs o construcciones de deleción / sobreexpresión específicos de tejido. Por otra parte, las similitudes funcionales entre humanos y ratones con respecto a los tendones flexores ¹¹ indican la utilidad potencial en el desarrollo de un modelo murino.

Desarrollo de un modelo murino de la transección del tendón flexor y reparación imita muchos aspectos de la curación clínica, incluyendo la formación de tejido cicatricial abundante y propiedades mecánicas reducidas. El modelo descrito aquí no es un verdadero recapitulación de la práctica clínica debido a la transección de la FDL en la unión miotendinosa el fin de proteger el sitio de reparación. Además, este modelo no tiene en cuenta la contribución de las células de la vaina sinovial de la respuesta de curación, ya que no hay vaina sinovial que cubre la porción media del tendón donde se produce la reparación. A pesar de estas limitaciones, este modelo tiene la ventaja de rango de generación de adherencias que limita el movimiento, el cual aún no se ha demostrado en modelos murinos que más closEly aproximar el escenario clínico. Este modelo ha sido utilizado para evaluar los modelos de ratón knock-out ^12,13, y para probar diferentes enfoques farmacológicos para mejorar la cicatrización ^14-17. Análisis histológicos de este modelo, mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ, puede proporcionar importantes conocimientos en la localización de genes y proteínas clave durante la curación. Sin embargo, la histología proporciona sólo un análisis espacial de la sección transversal y no permite la cuantificación en todo el tejido. La citometría de flujo representa un enfoque más cuantitativo, pero sólo un número muy limitado de células puede ser aislado a partir del tejido del tendón de la curación en el modelo de ratón, y este número se reduce aún más durante la fijación, permeabilización, y etapas de lavado. Teniendo esto en cuenta a, citometría de flujo se convierte en un enfoque inviable debido a la cantidad de animales que se requeriría. Un método alternativo es necesario para preservar la mayor parte de esta pequeña población de células con el finpara caracterizar mejor el medio de curación. El método utilizado para lograr esto, se muestra aquí, implica la concentración de las células aisladas mediante centrifugación citología en un portaobjetos de vidrio, seguido por inmunocitoquímica. En el presente estudio EdU (5-etinil-2'deoxyuridine, un análogo de la timidina) se utilizó incorporación y posterior etiquetado para determinar el estado de proliferación relativa de células en el sitio de curación. Este enfoque se puede aplicar para probar la eficacia de los tratamientos farmacológicos en la proliferación celular, el gen knock-out o sobreexpresión, o para identificar y cuantificar diferentes poblaciones de células.

Protocol

El Comité Universitario de Investigación Animal de la Universidad de Rochester aprobó todos los experimentos con animales. Diez-12 semanas de edad C57BL / 6J se utilizaron. 1. Preparación de los animales para la cirugía del tendón flexor (~ 15 min) instrumentos quirúrgicos autoclave para esterilizar, usan guantes estériles en todo, y mantienen un campo quirúrgico estéril. Anestesiar al ratón a través de inyección intraperitoneal (ip) con un volumen de ketami…

Representative Results

El flexor largo de los dedos (FDL) muscular, situado en la pantorrilla, actúa para flexionar los dedos de la pata trasera del ratón a través del tendón flexor (esbozado en azul en la Figura 1A, y se muestra histológicamente en la Figura 2A), que se extiende proximalmente desde el miotendinosa unión y termina en las falanges distales. En este modelo de cicatrización del tendón flexor, el tendón FDL se secciona y se repara en la parte media del pi…

Discussion

El procedimiento quirúrgico para un modelo murino de la transección completa y la reparación del tendón flexor largo de los dedos se presenta en este estudio. Además, se demostró una nueva aplicación de la concentración de las poblaciones de células pequeñas con centrífuga citología, lo que permite el análisis inmunocitoquímico cuantitativa del entorno celular durante la cicatrización del tendón flexor. Este modelo de reparación del tendón flexor demuestra una respuesta de curación reproducible, que s…

Materials

Surgical preparation
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	000664
Ketamine	Hospira	NDC# 0409-2051-05
Xylazine	Lloyd Inc.	NDC# 61311-482-10
Buprenorphine	Par Pharmaceutical Inc.	NDC# 42023-179-10
0.9% sodium chloride irrigation	Hospira	NDC# 0409-6138-03	For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions
1ml syringe	BD	309659
30G needle	BD	305106
Povidone-Iodine solution	Aplicare	82-226
70% ethanol
Puralube vet opthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	NDC# 17033-211-38
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools
Portable balance 200g	Ohaus	SP202
Spring scissors	Fine Science Tools	15124-12
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Needle holders	Fine Science Tools	91201-13
Micro spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro needle holders	Fine Science Tools	12061-02
5-0 nylon sutures	Ethicon	668G
8-0 microsurgery nylon sutures	Ethicon	2808G
Lab-Line histology slide warmer	Barnstead International	26025
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytospin method
Collagenase Type I, lyophilized	Life Technologies	1700-017
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technologies	9998S
1X PBS	Thermo Fisher	10010-023
Cytology funnels	Fisher HealthCare	10-354
HistoBond+ microscope slides	VWR	16005-110
Cytospin 2 centrifuge	Shandon	SH-CYTO2
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunocytochemistry
Slide staining tray with black lid	IHC World	M920-2
Click-iT Plus EdU Imaging Kit	Life Technologies	C10639	Includes EdU and  Hoeschst 33342
Immedge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
ProLong Diamond mounting medium	Thermo Fisher	P36970
Glass coverslips 24x50mm #1.5
Clear nail polish