We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
微流体探头(MFP)有利于通过限制液体纳升体积进行生物基化学地方。利用一种特定实现MFP的,分层的流体动力流体密封(hHFC)的,多种液体在与基底接触的同时带来了。使用hHFC当地的化学作用和液体成型,被利用,被当地裂解和去除细胞创建小区模式。通过利用MFP的扫描功能,创建细胞单层的用户定义的模式。这个协议允许快速,实时和空间控制的小区图案形成,其可允许选择性细胞 – 细胞和细胞 – 基质相互作用的研究。
在他们的本地环境中,细胞在生物组织中感知一系列生物化学和物理线索指导他们的成长,组织和发展。理解这些线索需要细胞 – 细胞和细胞 – 基质相互作用的选择性调查。这就需要对图案形成细胞单层方法的发展。方法培养(图案)几何独立不同的细胞类型的能在细胞生物学的物理和化学线索广泛的研究。最让图案细胞层当前的办法1 – 4取决于表面上沉积细胞粘附蛋白或使用微制造的模具在衬底上选择性生长。与此相反,在这里我们提出了一个方法来快速原位图案细胞单层, 即 ,将细胞在培养,通过在单层的选择区域中去除细胞。 9 usua –执行这样的减法图案5种方法LLY需要专门基板,表面处理,操作复杂,物理接触或消融使用激光,无意中影响活细胞。我们在这里使用的微流体探针(MFP)10,11,一个非接触式扫描微流体技术,流体动力地限制在衬底上的液体。在MFP中的一个重要组成部分是含微通道的微加工头( 图1)。相关平台由注射泵为液体控制阶段的扫描控制和可视化和反馈( 图2)的倒置显微镜。在其基本配置中,MFP头包括在顶点2微通道有孔,一个用于喷射处理液和其它用于与一些浸没液体( 图3A)一起抽吸注入处理液。期间的MFP操作中,顶点是在从基板的固定距离。当吸流量(QA)是sufficiently比喷射流量(Q i)中 , 也就是更高,Q 一个 : 数 Q i≥2.5,则处理液体被限制在衬底上。这导致了流体动力流动限制烃(HFC)。在其中处理液是在与基片直接接触的区域被称为足迹。对典型的操作条件时,处理液的HFC内的流的特征在于低的雷诺数(Re≈10 -2)和高的Peclet数(PE≈10 2)。这意味着流动液体在层流制度与对流是化学物种的质量传递的主要方式。流量限制数值和分析模型在别处描述12 – 14。
在本文中,我们使用的同时限制多个处理液体的方法,这就是所谓的分层HFC(hHFC)14。为了与MFP实现hHFC,二additiona需要升小孔提供注塑和愿望的次要来源。这使我们能够第二液体内限制一个液体。从内(处理)液体好处从杂散碎屑屏蔽由外(屏蔽)液体在衬底上。此外,hHFC允许以两种模式操作:(i)所述的嵌套模式,其中在所述内的HFC接触表面( 图3B),和(ii)的捏模式,其中内液体失去处理液接触,并只有外液是在与基板( 图3C)接触。两种模式之间的切换,用户可以影响或停止处理基板,并通过控制头-表面间隙或通过改变喷射流之间(Q i2的 / Q 的i1)的比率来实现的。对于给定的信道的几何形状,处理液的基板上的足迹可以通过调节流动条件( 图3D)来控制。 HYDR钠氧化物氢氧化钠(NaOH)用作内处理液来裂解细胞,并且裂解物连续地从表面吸出。因为处理液的化学作用被定位于内的HFC足迹,相邻细胞保持未被干扰,这允许细胞 – 细胞相互作用的时空研究。 MFP的扫描功能允许( 图4)的单元图形用户定义的几何形状的创建。此外,使用NaOH作为处理液的选择可容纳下游DNA分析( 图7)。
我们提出了一个通用的协议,用于细胞单层的减色图案化,使快速产生的空间限定单元图形。细胞单层的选择性裂解使用NaOH作为hHFC处理液进行的。该NaOH瞬时变性包含在细胞膜中的蛋白质。我们建议使用氢氧化钠50 mM的浓度,以保证裂解下游加工。该浓度可以为更快速细胞除去增加,提供裂解物下游加工是不是目的。在hHFC确保了细胞单层的未处理周围区域保持不受影响,并且可用于通过扩展图案或探测单元的其它性质。
细胞去除的速率是由流呈现的化学和剪切两者的函数。我们选择流率的操作范围有化学占主导地位的细胞去除。 20&# – 10扫描速度181;米/使用的6氢氧化钠喷射流量秒 – 8微升/分钟用于促进'快速'减色图案化。细胞去除的速度迅速解决所面临的表面印刷了一些挑战基于图形化方法20,21。这些方法需要一个机制,以限制在空间上定义的区域的细胞的生长,例如,通过经由微接触印刷和细胞随后接种以获得图案细胞粘附蛋白的选择性沉积。它们是由低吞吐量的限制,并需要对图案生成几个连续步骤以及为每个图案的新模版/印章。所描述的方法并不需要上定义的区域的细胞的选择性生长,并通过执行相反印刷减色构图克服若干限制,同时不需要的细胞培养基材的任何额外的处理。
有了这个文件中提出的协议,吞吐量图案的细胞单层增加,同时获得所产生的图案的即时视觉反馈。这便于图案的实时修改。这样的控制可能在方案中的给定表面上的细胞活力是不均匀的关键。该方法的另一个优点是,相同的头部和化学可用于生成多个模式,从而减少了参与生成有图案的细胞单层的步数。
在头部的通道和头几何形状的尺寸可以根据应用的要求进行调整,从而使在图案形成的分辨率控制。使用的MFP头具有固定孔的尺寸与内孔在100×100微米的孔和侧孔,在200×100微米的进行在当前的工作所有实验中,具体。之所以选择这样的设计具有更大的外侧孔,以确保hHFC的连续操作而不被堵塞的孔的杂散细胞碎片。我们已经与内孔尺寸测试头50×50微米以及它们之间的50微米的间距,与细胞去除成功的结果。使用更小的孔,下降到10×10微米与10微米的间距,将允许缩放到更小的体积大小(〜30×30微米),从而使在图案形成更高的分辨率。我们观察到的业务问题与孔径尺寸小于10微米,由于从微粒堵塞。因为这样的操作上的困难,100微米是分辨率的电流限制,因此所描述的技术的限制。然而,我们也可以使用hHFC的液体成形能力解决这一问题。我们已经证明,细胞去除的分辨率可以通过控制Q I2 / Q I1被调谐为一组给定的光圈尺寸( 图4b)和顶点到基板间隙10,14。在目前的工作中使用的阶段具有100nm的最小步长。这些控制参数的组合可以提高细胞去除在封装尺寸和扫描距离方面的空间分辨率。
如果图案化的共培养物所需的研究不同细胞类型之间的特异性细胞 – 细胞相互作用,可以使用所描述的协议来执行顺序的播种和图案化。最后,可从裂解物通过DNA中的单数峰获得的高质量扩增的DNA,如明显熔化曲线( 见图7)。我们评估的周围1.6从单足迹(约300个细胞)使用qPCR,这是接近理论预期(6-8皮克/细胞)纳克的DNA量。这表示适于几个下游过程而避免使用任何DNA分离方法提取的DNA的量。这开辟了途径DNA的分析为基础的地方培养细胞的探测。 hHFC的塑造液体的能力也可用于沉积上交流活细胞和蛋白质tivated表面,其在与该协议提出的减色图案和顺序共培养组合能够对培养基材复杂的细胞和细胞 – 基质的图案的创建。多功能性和细胞单层的基于hHFC,消减图案和表演上提取的细胞DNA分析的可能性提供的控制,提供了一个强大的新工具设置为生物学家执行涉及细胞的相互作用空间分辨的研究。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |