JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Хлорного железа-индуцированной мышиной модели Тромбоз

Published: September 05, 2016
doi:
10.3791/54479
, ,
1Department of Cellular and Molecular Medicine,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine,Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology,Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University

Summary

Мы сообщаем о изысканную процедуру хлорида железа (FeCl 3) индуцированный моделей тромбоз на сонной и брыжеечной артерии, а также вены, характеризующийся эффективно использовать прижизненной микроскопии для контроля времени окклюзионные тромбообразования.

Abstract

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introduction

Артериальный тромбоз (сгусток крови) является частым осложнением многих системных заболеваний, связанных с хроническим воспалением, включая атеросклероз, сахарный диабет, ожирение, рак и хронические аутоиммунные ревматологических заболеваний. Тромбы, которые происходят в стволе артериальной циркуляции с несоответствующей активацией тромбоцитов, агрегации и последующих coagulatory механизмов, а также участвуют в сердечных приступов, инсультов и потери конечностей. Стенка сосуд представляет собой сложную систему , которая включает в себя различные типы клеток и зависит от множества внешних факторов , в том числе напряжения сдвига, циркулирующих в крови клеток, гормоны и цитокины, а также экспрессию антиоксидантных белков в стенке сосуда. В пробирке эксперименты не может реплицировать это сложная среда , и поэтому в естественных условиях исследования с использованием животных моделей имеют решающее значение для обеспечения лучшего понимания механизмов , участвующих в тромботических заболеваний.

Мыши было показано, что симИЛАР механизмы для человека с точки зрения тромбоз, атеросклероз, воспаление и диабета 1,2. Кроме того, трансгенные и нокаутные мыши могут быть созданы для тестирования функции специфических генных продуктов в сложном физиологическом или патологическом среде. Такие исследования имитировать патологии человека и может предоставить важную механистическую информацию, связанную с открытием новых путей и методов лечения, а также обеспечивают важные детали при характеристике эффекты препарата на тромбоз.

Патологические артериальных тромбов происходят из – за эндотелиального повреждения слоя или дисфункции и воздействия на поток крови к субэндотелиальном матрицы 3,4. Различные модели тромбоз, были разработаны , чтобы вызвать это повреждение эндотелия , таких как механическое повреждение, фотореакционноспособная соединение бенгальский розовый на основе окислительного повреждения и лазерной травмы 5. В этом спектре, хлорид железа (FeCl 3) индуцированный сосудистых повреждений является широко используемой моделью тромбоза. Этот реагент, когдаприкладывается к внешней аспекту сосудов вызывает окислительное повреждение клеток сосудов 6-8, с потерей защиты эндотелиальных клеток от циркулирующих тромбоцитов и компонентов каскада свертывания. Модель FeCl 3 проста и чувствительна к обоим антикоагулянта и анти-Тромбоциты препаратов, и было выполнено на сонных и бедренных артерий, яремной вены, и брыжеечных и cremasteric артериолы и венулы у мышей, крыс, морских свинок и кроликов 6-15.

Один измеряемый параметр в этой модели является то, время , прошедшее после травмы до полной окклюзии сосуда, измеряемое как прекращение кровотока с помощью измерителя потока Доплера или под непосредственным наблюдением с прижизненной микроскопии 6,7,9. Диапазон времени от 5 до 30 мин, как сообщается в различных исследованиях в C57BL6 мышей 7-10,16, предполагая , что концентрации FeCl 3, виды анестезии, хирургических методов, мыши возраста, геномную фона, метод измерения BLOOD потока, а также других параметров окружающей среды оказывают значительное влияние в этой модели. Эта широкая изменчивость затрудняет сравнивать исследования из различных исследовательских групп и может сделать обнаружение тонких различий трудно.

С видением , чтобы свести к минимуму такие изменчивости и установить равномерно воспроизводимые в модели естественных условиях системы, мы усовершенствовали модель артерии индуцированная сонной FeCl 3 , что делает данные с высокой воспроизводимостью с минимальным изменением 6-10,16-19. В этой статье мы описываем и делиться навыками и сообщают о нескольких репрезентативных экспериментальных примеров, которые могут извлечь выгоду из этой модели.

Protocol

Все процедуры и манипуляции животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов (IACUC) из клиники Кливленда в соответствии с политикой Соединенных Штатов службы общественного здравоохранения на гуманное лечение и использовании животного мира , а также в <em…

Representative Results

Сонная артерия Тромбоз Модель У мышей с C57BL6 фоне, мы рекомендуем использовать 7,5% FeCl 3 для лечения сосуда в течение 1 мин в качестве отправной точки. Под обработкой 7,5% FeCl 3, границы поврежденной области и нормальной стенки сосуда легко идентифици?…

Discussion

FeCl 3 индуцированную модель является одним из наиболее широко используемых моделей тромбоз, который может не только предоставить ценную информацию о генетических модификаций на функции тромбоцитов и тромбоза 7,8,16,19,31-33, но также может быть ценным инструментом для оценки тер?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Surgical Scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J., et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K., Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Tags

Keywords: Ferric Chloride-induced ThrombosisMouse Carotid Artery ModelIntravital MicroscopyPlatelet ActivationThrombosisAnticoagulantAntiplatelet DrugsPathophysiology Of ThrombosisNovel DrugsTargeted NanomedicineFur RemovalSurgical IncisionJugular Vein DissectionRhodamine 6G Solution
check_url/kr/54479?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image