Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail
Summary
The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.
Abstract
Le coeur de mammifère est un grand consommateur d'ATP et nécessite un apport constant de substrats énergétiques pour la contraction. Sans surprise, les altérations du métabolisme du myocarde ont été associés au développement d'un dysfonctionnement contractile et l'insuffisance cardiaque. Par conséquent, démêler le lien entre le métabolisme et la contraction devrait faire la lumière sur certains des mécanismes qui régissent l'adaptation cardiaque ou maladaptation dans les états pathologiques. L'isolement de travail de préparation de coeur de rat peut être utilisé pour suivre simultanément et en temps réel, la fonction contractile cardiaque et le flux d'énergie fournissant des substrats dans des voies métaboliques oxydatives. Le présent protocole vise à fournir une description détaillée des méthodes utilisées dans la préparation et l'utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d'oxydation du glucose et des acides gras, l'énergie principale fournissant des substrats du cœur. Les méthodes utilisées pour l'analyse de l'échantillon et l'interprétation des données sont également discutés.En bref, la technique est basée sur la fourniture de 14 C- glucose radiomarqué et un acide gras à longue chaîne radiomarqué 3 H- à un cœur battant ex vivo par perfusion cristalloïde normothermique. 14 CO 2 et 3 H 2 O, fin des sous – produits de les réactions enzymatiques impliquées dans l'utilisation de ces substrats énergétiques fournissant, sont ensuite quantitativement récupérées à partir de l'effluent coronaire. Avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans les voies d'oxydation. la fonction contractile du cœur isolé peut être déterminée en parallèle avec l'appareil d'enregistrement approprié et directement corrélé aux valeurs de flux métaboliques. La technique est très utile pour étudier la relation métabolisme / contraction en réponse à diverses conditions de stress telles que des altérations de pré et après la charge et de l'ischémie, un médicament ou un circulafacteur ting ou après la modification de l'expression d'un produit génique.
Introduction
Pertinence clinique
Au coeur des mammifères, il existe une forte relation positive entre le flux de substrats par les voies métaboliques oxydatives, la génération d' ATP et le travail cardiaque 1. Au cours des deux dernières décennies, l'enquête sur le lien complexe entre le métabolisme et la fonction cardiaque a conduit à reconnaître que des altérations du métabolisme cardiaque sont une cause de dysfonctionnement contractile et le remodelage structurel éventuellement pathologique dans le cadre de différents types de maladies cardiaques 2-4. Par conséquent, il est prévu que notre compréhension des mécanismes qui régissent le remodelage métabolique du cœur souligné conduira à l'identification de cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement de l' insuffisance cardiaque 5-7. La récente publication d'une déclaration scientifique de l'American Heart Association sur «l'évaluation cardiaque du métabolisme», souligne l'intérêt croissant de la communauté scientifique pour tson domaine de recherche 8. Mais alors que les avancées technologiques en imagerie cardiaque permettent maintenant d'une évaluation rapide et précise de la morphologie et de la fonction cardiaque, l'étude in vivo du métabolisme cardiaque reste limitée et lourde: résonance magnétique (RMN) et nucléaire tomographie par émission de positons (TEP) peut être utilisés pour suivre le métabolisme du phosphate de haute énergie cardiaque et l' activité du cycle de Krebs, mais ces techniques sont en proie à des coûts d'exploitation élevés et par leur incapacité à déterminer la contribution des différents substrats au métabolisme oxydatif dans des conditions stables 9 .Pour cette date , l'ex vivo travail de préparation cardiaque représente la technique seule et unique disponible pour étudier, simultanément et en temps réel, la fonction contractile et flux de substrats dans des voies métaboliques oxydatives 7,9. Le protocole suivant a pour but de fournir des lignes directrices pour la préparation et l'utilisation des réactifs utilisés pour déterminer le rates de substrats utilisation dans le coeur de rat de travail isolé.
Le Coeur Appareil Rongeur de travail isolé
Bien que la technique est vieille presque un demi-siècle, le travail isolé préparation de coeur de rat reste une méthode de choix pour la recherche cardiovasculaire. Comme pour la préparation cardiaque Langendorff, le cœur de rongeur de travail offre un moyen relativement simple, fiable et peu coûteux pour mesurer une large gamme de paramètres cardiaques, indépendamment des effets de confusion d'autres organes, neurohormonales et d'autres facteurs qui circulent. Mais contrairement au coeur Langendorff perfusé, le cœur de travail continue d'effectuer le travail cardiaque quasi-physiologique, une condition préalable à la génération de flux métabolique oxydative à des niveaux qui sont pertinents pour les conditions in vivo. Ceci est réalisé en fournissant le tampon de perfusion dans le ventricule gauche (VG) par l'intermédiaire d'une canule reliée à l'oreillette gauche, et que le LV se remplit et se contracte, letampon est éjecté à travers la ligne aortique contre une pression hydrostatique de postcharge déterminée. La conception de l'appareil de perfusion décrit initialement par Neely et ses collègues 10 a ensuite été améliorée par Taegtmeyer, Hems et Krebs 11, mais a très peu changé depuis. Comme décrit dans l'appareil d' origine, la fonction contractile peut être évaluée grâce à la détermination du débit cardiaque, sans utiliser des cylindres de plus de diplômés et un chronomètre pour mesurer aortique et coronaire flux 10,11. Plusieurs fournisseurs offrent maintenant des systèmes complets coeur de perfusion de rongeurs de travail. Ces appareils disponibles dans le commerce peut être acquise avec flowprobes, transducteurs de pression, un cathéter pression-volume et tout l'équipement nécessaire à l'acquisition de données fonctionnelle cardiaque et d'analyse. Les vendeurs offrent de nombreuses sessions de documentation et de formation pour familiariser le nouvel utilisateur avec leur équipement. Plusieurs articles de revue également les protocoles de détail sur le instrum travail cardiaqueentation et sur l'utilisation de cathéters pour mesurer la fonction cardiaque chez les rongeurs 12-15. Pour cette raison, nous allons brièvement parler de la mise en place de l'appareil de perfusion et de l'équipement d'enregistrement. Le présent protocole vise plutôt à compléter les informations déjà disponibles avec une description des méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour mesurer simultanément les taux de glucose et de l'oxydation des acides gras à longue chaîne, les deux substrats énergétiques fournissant majeurs dans le cœur normal. Nous décrivons ici toutes les étapes impliquées dans l'utilisation des substrats énergétiques radiomarqués pour l'évaluation du métabolisme oxydatif du myocarde, de la préparation des réactifs et des tampons à la récupération et le traitement des échantillons, à l'analyse des données.
Principes de la méthode
Cardiomyocytes génèrent la plus grande partie de leur énergie pour la contraction de la phosphorylation oxydative d'acides gras (principalement des acides gras à longue chaîne) et des glucides (glucose et de lactate). Le cœur a très limité des réserves énergétiques et repose sur un approvisionnement constant de ces énergies fournissant des substrats de la circulation. Le catabolisme du glucose par la voie glycolytique donne pyruvate, qui est ensuite décarboxylé par le complexe pyruvate déshydrogénase de la membrane mitochondriale interne. Les acides gras à longue chaîne, extraits de l'albumine circulante ou des triglycérides de lipoprotéines sont d'abord activés dans des molécules d'acyl-CoA dans le cytosol et ensuite transporté à l'intérieur de la matrice mitochondriale par l'intermédiaire de la navette carnitine pour entrer dans la voie bêta-oxydation. Les molécules d'acétyl-CoA produites par le catabolisme du glucose et des acides gras alimentent le cycle de Krebs pour générer les équivalents réducteurs (NADH et FADH 2) qui sont utilisés par la chaîne de transport d'électrons pour créer la force proton motrice à travers la membrane mitochondriale interne et générer l'ATP par l'activité de l'ATP synthase. L'eau et le dioxyde de carbone sont les sous-produits d'extrémité deles réactions enzymatiques qui se déroulent à l'intérieur du cycle de Krebs. La fourniture de 14 C et 3 H- substrats radiomarqués (tels que le glucose 14 C-radiomarquée et l' acide oléique radiomarqué 3 H) au travail cardiaque isolé sera par conséquent conduire à la production de 14 CO 2 et de H 2 O 3 qui peut être quantitativement récupéré de l'effluent coronaire. La collecte de 14 CO 2 est réalisée en maintenant le cœur isolé perfusé dans une chambre étanche et en récupérant immédiatement l'effluent coronaire à sa sortie du coeur. Une petite colonne d'échange d'anions est utilisée pour séparer et récupérer 3 H 2 O dans l'effluent coronaire. La radioactivité des échantillons traités est mesurée avec un compteur à scintillation liquide, et avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans laoxydation pathways 16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole précédent décrit en détail les méthodes pour quantifier simultanément le flux du substrat à travers l'oxydation du glucose et de l'oxydation des acides gras dans le coeur de rat isolé de travail. Les mesures peuvent ensuite être superposées aux paramètres fonctionnels cardiaques enregistrés pour déterminer la relation entre les substrats du métabolisme et du travail cardiaque sous base et le stress des conditions (changement dans la charge de travail, l' ischémie-reperfusion, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grants R00 HL112952 (to R. H.), R01 HL108618 (to J.P.G.), P01 HL051971, and P20 GM104357. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 resin, chloride form, 100-200 dry mesh size, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form (see reference below), but this will cost almost 8 times more |
| AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100-200 dry mesh size, 100 g | Bio-Rad | 1432445 | Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol) |
| Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage. |
| Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder | EMD Millipore | 820027 | We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart. |
| Sodium Oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Inactin Hydrate | Sigma-Aldrich | T133 | Controlled substance on USDEA Schedule III |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10X Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| 20 mL Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-341-25E | Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2 |
| 20 mL HDPE Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-337-23B | Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O |
| Red Rubber Sleeve Stoppers | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit 20 mL scintillation vials; Reusable |
| BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm | BD | 305194 | Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap |
| Perchloric Acid, 60% | Fisher Scientific | A228 | Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Glass Wool | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Detergent Powder | Fisher Scientific | 04-355 | For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing |
| Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent | Fisher Scientific | 16-000-115 | For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue |
References
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
- Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
- Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
- Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation–a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
- Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
- Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
- Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
- Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
- Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
- Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
- Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
- Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. 생화학. 6, 1-5 (1967).
- Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
- Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
- Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
- Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?. Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
- Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
- Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
- Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
- Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
- Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
- Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
- Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia’s effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
- Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?. J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
- Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
- Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion–a Jekyll and Hyde effect?. Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
- Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! . Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).
