非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例
Summary
ここでは、非透明なチタン足場に細胞生存率を検出するだけでなく、足場不純物の見え隠れを検出するためのフルオロフォアベースのイメージング技術を提示します。このプロトコルは、非透明の足場上のイメージング細胞 – 細胞または細胞 – 金属相互作用の欠点をトラブルシューティングします。
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
慢性腰痛は多因子疾患です。椎間板変性疾患に対する低侵襲性治療の選択肢への関心は、1950年代から成長してきました。今日まで、脊柱のマルチセグメントの融合は、最も広く使用されている治療法です。以来、この方法は、多くの場合、影響を受けたセグメント1,2の移動度の制限につながり、関節形成術の時代の探査は、広い関心となりました。総椎間板置換および核置換における重要な進歩は、慢性腰痛1を治療するための良い代替となっています。巨大な進歩にもかかわらず、方法のいずれも臨床的に評価されていません。低剛性核インプラントは、総椎間板置換に有望な代替を表す線維輪が3,4無傷であることを条件とします。しかし、現在市場に存在する核インプラントは、多くの場合、椎体の変化、脱臼、椎間板の垂直高さ損失およびトンなどの合併症に関連付けられています必要に応じて、関連する機械的剛性5の彼が欠如。現在の欠点を克服するために、編みチタンワイヤからなる新規な核移植に成功6開発されています。ユニークなニット構造のために、この新たに開発された足場は、 例えば著名な生体力学的特性、減衰機能、細孔サイズ、積載能力と信頼性7を示しています。この小説核インプラントの生体適合性をテストするために目指して、インプラントの非透明な性質に起因する（光）解析技術に厳しい制限を描きました。
生体適合性を試験するために、細胞-金属相互作用が重要な役割を果たしている8-10。細胞および骨格の間の相互作用は、ホストシステム内のより良いインプラント統合のための安定化、したがって、必要です。しかし、増加内方成長の深さは、足場の機械的特性を変化させる可能性があります。 invesに目指して足場表面は細胞の付着、増殖および分化、またはのための基盤を提供しているかどうかtigate金属は、細胞の生存率に影響を与えるかどうか、それは非透明と不透明の足場に/上の細胞を画像化する一般的な周知の問題のトラブルシューティングを行うことが重要です。この制限を克服するために、いくつかの蛍光に基づく技術を調査しました。企業は生きている細胞、細胞区画、あるいは特定の細胞状態11を可視化する蛍光体の大規模な範囲を提供します。この実験のためのフルオロフォアは、最高の我々の蛍光顕微鏡に適合するために、オンラインツールスペクトル視聴者の助けによって選択しました。
上の細胞の追跡を可能にするためにosteochondro-前駆細胞の1）蛍光（緑色蛍光タンパク質/ GFP）の標識：非透過ニットチタン足場内/上の接着細胞の挙動の分析のための開発戦略は、以下を含み、足場、2）の生存率を測定する（水戸市chondrial細胞の活性）、および3）足場内の細胞 – 細胞および細胞 – 材料相互作用を可視化します。手順は、簡単に他の付着細胞および他の非透明または不透明な足場に転送することができるという利点を有します。さらに、生存率および内部成長パターンが数日間にわたって監視することができ、したがって、足場材料又は細胞の限られた量で使用することができます。
本研究は、細胞生存率を測定し、非透過ニットチタン足場に/上osteochondro-前駆細胞の内部成長パターンを可視化するために私たちの現在のプロトコルの使用の成功を示しています。また、開発されたプロトコルは、足場の不純物を決定するために、洗浄プロトコルを確認するために使用され得ます。
Protocol
Representative Results
Discussion
足場の表面は、それによってインプラントに機能的な耐久性を決定するインビボで周囲組織との相互作用において重要な役割を果たしています。したがって、足場の生体適合性の足場上に播種する細胞を用いたin vitroアッセイ（SCP1細胞株）によって研究されています。
薄く、光学的に透明な足場で良好な性能を発揮顕微鏡技術は十分に生体適合性を研究す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロジェクトは、部分的にZentrales Innovationsprogrammミッテルシュタント（ZIM）デBundesministeriumsエリーゼWirtschaftウントエナジー-KF3010902AJ4によって運営されています。公開手数料は、BG外傷病院テュービンゲン、ドイツによってカバーされています。
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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