Imaging levensvatbaarheid van de cellen op niet-transparante Steigers - Met behulp van het voorbeeld van een Novel Gebreide Titanium Implant
Summary
Hier presenteren we een fluorofoor gebaseerde beeldvormende techniek om cellevensvatbaarheid te detecteren op een ondoorzichtige titanium draagstructuren alsook oogopslag van de steiger verontreinigingen te detecteren. Dit protocol oplossen van problemen met het nadeel dat de beeldvorming van cel-cel of cel-metaal interacties op ondoorzichtige steigers.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
Chronische rugpijn is een multifactoriële aandoening. De belangstelling voor een minimaal invasieve behandeling optie voor de degeneratieve discopathie is gegroeid sinds de jaren 1950. Tot op heden, multi-segmentale fusie van de wervelkolom is de meest gebruikte behandeling. Aangezien deze werkwijze vaak leidt tot beperkingen in de beweeglijkheid van het aangetaste segment 1,2 verkenning van het artroplastiek tijd werd een brede interesse. Significante verbeteringen in totaal schijfvervanging en kern vervangen is uitgegroeid tot een goed alternatief voor chronische rugpijn 1. Ondanks de enorme vooruitgang, geen van de werkwijzen is klinisch geëvalueerd. Hoe minder stijve kern implantaten zijn een veelbelovend alternatief voor totaal vervangingsschijf, mits de annulus fibrosus intact 3,4. Echter, de nog aanwezige kern implantaten in de handel vaak geassocieerd met complicaties zoals veranderingen in wervellichaam, dislocatie, verticale hoogteverlies van de schijf en tHij ontbreken van de nodige bijbehorende mechanische starheid 5. Om de huidige nadelen op te heffen, is een nieuwe kern implantaat gemaakt van titanium gebreide draden succes ontwikkeld 6. Door de unieke gebreide structuur heeft deze nieuw ontwikkelde scaffold getoond onderscheiden biomechanische karakteristieken, bijvoorbeeld dempende eigenschap, poriegrootte, het draagvermogen en de betrouwbaarheid 7. Gericht op de biocompatibiliteit van deze nieuwe kern implantaat testen, afgebeeld ernstige beperkingen in het (optisch) analysetechnieken toegekend aan niet-transparante karakter van het implantaat.
Om de biocompatibiliteit testen, cel-metal interactie speelt een prominente rol 8-10. Een interactie tussen de cellen en de steiger nodig is voor de stabilisatie en daarmee een betere integratie implantaat binnen het gastheersysteem. Er kan echter een toenemende diepte ingroei de mechanische eigenschappen van het schavot veranderen. Gericht op investigate of het schavot oppervlak verschaft een basis voor celhechting, proliferatie en differentiatie of dat de metalen cellevensvatbaarheid beïnvloedt, is het belangrijk om de gemeenschappelijke bekend probleem afbeelden van cellen op / in niet-transparante en ondoorzichtige steigers oplossen. Om deze beperking te overwinnen werden verscheidene fluorescentie gebaseerde technieken onderzocht. Bedrijven een groot aantal fluoroforen levende cellen, cellulaire compartimenten of zelfs specifieke cellulaire staten 11 visualiseren. Fluoroforen voor dit experiment werden gekozen met behulp van de online tool spectrale viewer om optimaal fit onze fluorescentiemicroscoop.
De ontwikkelde strategie voor de analyse van de hechtende cellen gedrag / in de ondoorzichtige gebreide titanium scaffold omvat het volgende: 1) fluorescerende (groen fluorescent proteïne / GFP) labeling van de osteochondro progenitorcellen te volgen van de cellen op het toestaan steiger, 2) het meten van de levensvatbaarheid (mitochondrial activiteit) van de cellen, en 3) het visualiseren van cel-cel en cel-materiaal interacties binnen de scaffold. De werkwijze heeft het voordeel dat het gemakkelijk kan worden overgedragen naar andere hechtende cellen en andere niet-transparant of ondoorzichtig scaffold. Bovendien kunnen de levensvatbaarheid en ingroei patroon worden gevolgd gedurende meerdere dagen, kan dus worden gebruikt met beperkte hoeveelheden dragermateriaal of cellen.
De onderhavige studie toont de succesvolle toepassing van de huidige protocol bij de cellevensvatbaarheid gemeten en gevisualiseerd in groeipatroon van osteochondro progenitorcellen op / in de ondoorzichtige gebreide titanium draagstructuren. Bovendien zou de ontwikkelde protocollen worden gebruikt om het schavot onzuiverheden bepalen en reinigingsprotocollen controleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het schavot oppervlak speelt een belangrijke rol in de interactie met omringende weefsel in vivo waarbij bepaald implantaten functionele duurzaamheid. Aldus wordt de biocompatibiliteit van de scaffold door in vitro assays cuvetten (SCP1 cellijn), bij het uitplaten op de steigers.
Microscopische technieken die goed functioneren met dun en optisch transparant steigers zijn slecht geschikt voor ondoorzichtige scaffolds de biocompatibiliteit te bestuderen. Dit komt vooral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Project wordt gedeeltelijk gefinancierd door Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. De publicatie honorarium is gedekt door de BG trauma ziekenhuis Tübingen, Duitsland.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
