गैर पारदर्शी scaffolds पर इमेजिंग सेल व्यवहार्यता - एक उपन्यास बुना हुआ टाइटेनियम प्रत्यारोपण के उदाहरण का उपयोग
Summary
यहाँ हम एक गैर पारदर्शी टाइटेनियम पाड़ पर सेल व्यवहार्यता का पता लगाने के साथ ही पाड़ अशुद्धियों की झलक का पता लगाने के लिए एक fluorophore आधारित इमेजिंग तकनीक मौजूद है। इस प्रोटोकॉल गैर पारदर्शी मचानों पर सेल सेल या सेल धातु बातचीत इमेजिंग का दोष troubleshoots।
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
पुराने पीठ दर्द एक multifactorial रोग है। अपक्षयी डिस्क रोग के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव उपचार के विकल्प में दिलचस्पी 1950 के बाद से वृद्धि हुई है। आज तक, स्पाइनल कॉलम की बहु कमानी संलयन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपचार है। चूंकि, इस विधि अक्सर प्रभावित खंड 1,2 की गतिशीलता में सीमाओं की ओर जाता है, संधिसंधान युग के अन्वेषण के लिए एक व्यापक हित हो गया। कुल डिस्क प्रतिस्थापन और नाभिक प्रतिस्थापन में महत्वपूर्ण प्रगति पुराने पीठ दर्द 1 के इलाज के लिए एक अच्छा विकल्प बन गया है। विशाल प्रगति के बावजूद, तरीकों में से कोई चिकित्सकीय मूल्यांकन किया गया है। कम कठोर नाभिक प्रत्यारोपण, कुल डिस्क प्रतिस्थापन के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं, बशर्ते कि तंतु वलय बरकरार 3,4 है। हालांकि, बाजार पर वर्तमान में मौजूद नाभिक प्रत्यारोपण अक्सर कशेरुका शरीर, अव्यवस्था, डिस्क और टी की खड़ी ऊंचाई घटाने में परिवर्तन जैसे जटिलताओं के साथ जुड़े रहे हैंवह आवश्यक संबद्ध यांत्रिक कठोरता 5 की कमी है। आदेश में मौजूदा खामियों को दूर करने के लिए, एक उपन्यास नाभिक प्रत्यारोपण बुना हुआ टाइटेनियम तारों से बना सफलतापूर्वक 6 विकसित किया गया है। अद्वितीय बुना हुआ संरचना के कारण, इस नव विकसित पाड़ प्रतिष्ठित बायोमैकेनिकल विशेषताओं, जैसे, भिगोना सुविधा, ताकना आकार, लदान क्षमता और विश्वसनीयता 7 दिखाया गया है। इस उपन्यास नाभिक प्रत्यारोपण के biocompatibility परीक्षण करने के लिए लक्ष्य, प्रत्यारोपण के गैर पारदर्शी स्वभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया (ऑप्टिकल) विश्लेषण तकनीक में गंभीर सीमाएं दर्शाया।
आदेश biocompatibility का परीक्षण करने के लिए, सेल धातु बातचीत एक प्रमुख भूमिका निभाता है 8-10। कोशिकाओं और पाड़ के बीच एक संवाद मेजबान सिस्टम के भीतर बेहतर प्रत्यारोपण एकीकरण के लिए स्थिरीकरण और इसलिए आवश्यक है। हालांकि, एक बढ़ती हुई अंतर्वृद्धि गहराई पाड़ के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन हो सकता है। जांच करने के लिए लक्ष्यtigate कि क्या पाड़ सतह सेल लगाव, प्रसार और भेदभाव या के लिए एक आधार प्रदान करता है धातु सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है या नहीं, यह गैर पारदर्शी और अपारदर्शी scaffolds में / पर कोशिकाओं इमेजिंग के आम प्रसिद्ध समस्या के निवारण के लिए महत्वपूर्ण है। आदेश में इस सीमा को कई फ्लोरोसेंट काबू पाने के लिए आधारित तकनीक का पता लगाया गया था। कंपनियों जीवित कोशिकाओं, सेलुलर डिब्बों, या यहां तक कि विशिष्ट सेलुलर राज्यों कल्पना करने के लिए 11 fluorophores की एक बड़ी रेंज प्रदान करते हैं। इस प्रयोग के लिए fluorophores क्रम में सबसे अच्छा हमारे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप फिट में ऑनलाइन उपकरण वर्णक्रम दर्शक की मदद से चुने गए हैं।
1) फ्लोरोसेंट (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन / GFP) osteochondro-पूर्वज कोशिकाओं की लेबलिंग पर कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति के लिए: गैर पारदर्शी बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ में / पर पक्षपाती कोशिकाओं के व्यवहार के विश्लेषण के लिए विकसित रणनीति का पालन करना शामिल पाड़, 2) व्यवहार्यता को मापने (Mitochondrial गतिविधि) कोशिकाओं की, और 3) visualizing सेल सेल और पाड़ के भीतर सेल-सामग्री बातचीत। प्रक्रिया लाभ यह है कि यह आसानी से अन्य पक्षपाती कोशिकाओं और अन्य गैर-पारदर्शी या अपारदर्शी पाड़ को हस्तांतरित किया जा सकता है। इसके अलावा, व्यवहार्यता और अंतर्वृद्धि पैटर्न कई दिनों में नजर रखी जा सकती है, इस प्रकार यह पाड़ सामग्री या कोशिकाओं की सीमित मात्रा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन के लिए हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के सफल प्रयोग सेल व्यवहार्यता को मापने और गैर-पारदर्शी बुना हुआ टाइटेनियम पाड़ में में विकास / पर osteochondro-पूर्वज कोशिकाओं के पैटर्न कल्पना करने के लिए यह दर्शाता है। इसके अलावा, विकसित प्रोटोकॉल आदेश पाड़ दोष का निर्धारण करने और सफाई प्रोटोकॉल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पाड़ सतह विवो में आसपास के ऊतकों जिससे प्रत्यारोपण कार्यात्मक स्थायित्व का निर्धारण करने के साथ अपनी बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार, पाड़ की जैव अनुकूलता इन विट्रो assays को?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
परियोजना आंशिक रूप से Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums फर Wirtschaft अंड Energie -KF3010902AJ4 द्वारा वित्त पोषित है। प्रकाशन शुल्क बीजी आघात अस्पताल Tübingen, जर्मनी द्वारा कवर किया गया है।
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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