비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여
Summary
여기에서는 불투명 티타늄 지지체에 세포 생존을 검출뿐만 아니라, 골격 불순물 일별을 검출하는 형광 기반 이미징 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 비 투명 지지체에 세포 세포 또는 세포 상호 작용 금속을 묘화의 결점이 문제를 해결합니다.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
만성 허리 통증은 다 인성 질환이다. 퇴행성 디스크 질환의 최소 침습적 치료 방법에 대한 관심은 1950 년대 이후 성장했다. 오늘날, 척추의 분절 다중 융합은 가장 널리 사용되는 치료는 상태가 될 때까지. 이후,이 방법은 종종 영향을받는 세그먼트 1, 2의 이동성의 한계에 이르게의 전 치환술 시대의 탐사는 넓은 관심이되었다. 전체 디스크 교체 및 핵 교체에 상당한 발전 만성 허리 통증 1을 치료하는 좋은 대안이되고있다. 거대한 진전에도 불구하고, 방법 중 어느 것도 임상 적으로 평가되지 않았다. 덜 엄격한 핵 이식은 전체 디스크 교체에 유망한 대안을 나타내는 섬유륜이 3,4 그대로 것이어야한다. 그러나, 시장에 현재 존재하는 핵 이식은 종종 추체, 전위, 디스크 및 t의 수직 높이 손실의 변화와 같은 합병증과 연관된필요한 관련 기계 강성 5 그는 부족. 현재의 문제점을 해결하기 위하여, 티탄 니트 와이어로 이루어지는 신규 한 핵 이식이 성공적 6 개발되었다. 때문에 독특한 니트 구조로, 새로 개발 된 인공 지지체는 예를 들어, 고유 생체 역학적 특성, 감쇠 기능, 기공 크기, 적재 능력 및 신뢰성 (7)을 보여 주었다. 이 새로운 핵 임플란트의 생체 적합성 시험을 목표 임플란트의 불투명 특성 기인 (광) 분석 기술에 심각한 제한을 도시.
생체 적합성을 테스트하기 위하여, 세포 – 금속의 상호 작용이 중요한 역할을한다 8-10. 세포와 지지체 사이의 상호 작용은 호스트 시스템 내에 더 주입 통합 안정화 때문에 필요하다. 그러나, 점점 증식 깊이는 지지체의 기계적 성질을 변경할 수있다. inves의 목표발판 표면은 세포 부착, 증식 및 분화 또는를위한 기반을 제공하는지 여부 tigate 금속은 세포 생존에 영향을 미치는 여부가 불투명 불투명 지지체에 /에서 세포 이미징의 공통 잘 알려진 문제를 해결하는 것이 중요하다. 이 제한 여러 형광을 극복하기 위해 기반 기술을 탐구 하였다. 기업은 살아있는 세포, 세포 구획, 또는 특정 세포 상태 (11)를 시각화 형광체의 넓은 범위를 제공한다. 이 실험 형광체 가장 우리 형광 현미경을 맞추기 위해 온라인 툴 스펙트럼 시청자의 도움으로 선택되었다.
온 세포의 추적을 허용하는 osteochondro-전구 세포는 1) 형광체 (녹색 형광 단백질 / GFP) 표지 : 불투명 니트 티타늄 지지체의 /에 부착 세포 거동의 분석을 위해 개발 된 전략들은 다음을 포함 지지체, 2) 측정 가능성 (미토chondrial 활동) 세포, 3) 시각화 세포 – 세포와 지지체에서 세포 물질의 상호 작용. 절차는 쉽게 다른 부착 세포 및 기타 비 투명 또는 불투명 지지체에 전사 될 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 생존 및 증식 패턴은 며칠에 걸쳐 모니터링 할 수있다 따라서, 이것은 지지체 재료 또는 세포의 제한된 양으로 사용될 수있다.
본 연구는 세포 생존율을 측정 불투명 니트 티타늄 지지체의 ON / osteochondro-전구 세포의 성장 패턴을 시각화 현재 프로토콜의 성공적 사용을 설명한다. 또한, 개발 된 프로토콜 골격 불순물을 결정하고 세척 프로토콜을 확인하기 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
골격 표면하여 임플란트를 기능적 내구성을 결정 생체 내에서 주변 조직과의 상호 작용에서 중요한 역할을한다. 따라서, 지지체의 생체 적합성의 지지체 상에 플레이 팅 세포를 이용한 시험 관내 분석법 (SCP1 세포주)에 의해 연구된다.
얇고 광학적으로 투명 지지체와 잘 작동 현미경 기술은 가난 생체 적합성을 연구하는 불투명 발판 적합합니다. 이것은 불투명 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 부분적으로 Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand에 (ZIM) 데 Bundesministeriums 대 Wirtschaft 싶게 에네르기 -KF3010902AJ4에 의해 투자된다. 발행 수수료는 BG 외상 병원 튀빙겐, 독일에 의해 덮여있다.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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