Визуализации Жизнеспособность клеток на непрозрачный строительные леса - на примере романа трикотажной Titanium Implant
Summary
Здесь мы представляем флуорофора на основе метод визуализации для выявления жизнеспособности клеток на непрозрачной титана эшафот, а также для обнаружения проблески примесей строительных лесов. Этот протокол устранение неполадок недостаток визуализации клетка-клетка или клетка-металл взаимодействий на непрозрачных каркасах.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
Хроническая боль в спине является многофакторным заболеванием. Интерес к минимально инвазивной вариант лечения для остеохондроза вырос с 1950-х годов. До сегодняшнего дня, мульти-сегментарный слияние позвоночника является наиболее широко используется лечение. Так как этот метод часто приводит к ограничениям в подвижности пораженного сегмента 1,2, стал широкий интерес разведке артропластики эпохи. Значительные достижения в полной замены диска и ядра замены стала хорошей альтернативой для лечения хронической боли в спине 1. Несмотря на огромный прогресс, ни один из методов не прошли клинические испытания. Менее жесткие имплантаты ядро представляют собой многообещающую альтернативу полной замены диска, при условии , что кольцевое Фиброзное цела 3,4. Тем не менее, в настоящее время представляют ядро имплантаты на рынке часто связаны с осложнениями, как изменения в теле позвонка, вывих, вертикальная потеря высоты диска и тон отсутствие необходимой соответствующей механической жесткостью 5. Для преодоления существующих недостатков, нового ядра имплантата из трикотажного проводов титана была успешно разработана 6. Благодаря уникальной трикотажной структуре, это недавно разработанный эшафот показал выдающиеся биомеханические характеристики, например, демпфирующие функции размер пор, загрузка емкости и надежности 7. С целью проверить биосовместимость этого нового ядра имплантата, изображены жесткие ограничения в (оптических) методов анализа, приписанных к непрозрачной природе имплантата.
Для того , чтобы протестировать биосовместимость, взаимодействие клеток-металл играет важную роль 8-10. Взаимодействие между клетками и эшафот необходимо для стабилизации и, следовательно, для более эффективной интеграции имплантата в хост-системе. Тем не менее, по мере увеличения глубины врастание может изменить механические свойства строительных лесов. С целью инвеtigate обеспечивает ли поверхность леска основу для прикрепления клеток, пролиферации и дифференцировки или влияет ли металл жизнеспособность клеток, важно устранить общую хорошо известную проблему визуализации клеток / в непрозрачные и непрозрачных каркасах. Для того, чтобы преодолеть это ограничение несколько флуоресцентных были изучены методы, основанные. Компании предоставляют широкий спектр флуорофоров для визуализации живых клеток, клеточных отсеков, или даже специфических клеточных состояний 11. Флуорофоры для этого эксперимента были выбраны с помощью онлайн-инструмента спектрального зрителя для того, чтобы наилучшим образом соответствовать нашим флуоресцентного микроскопа.
Разработанная стратегия для анализа клейкого поведения клеток в / в непрозрачном трикотажного титана эшафот включает в себя следующее: 1) люминесцентная (зеленый флуоресцентный белок / GFP) мечение osteochondro-клеток-предшественников, чтобы отслеживать клеток на подмости, 2) измерение жизнеспособности (митоchondrial активность) клеток, и 3) визуализации клеток-клетка и клетка-материал взаимодействия внутри строительные леса. Процедура имеет преимущество в том, что она может быть легко перенесены на другие адгезивные клетки и прочие непрозрачные или непрозрачной помост. Кроме того, жизнеспособность и врастание модель можно контролировать в течение нескольких дней, при этом он может быть использован с ограниченным количеством каркасного материала или клеток.
Настоящее исследование демонстрирует успешное использование нашего текущего протокола для измерения жизнеспособности клеток и визуализации в-модель роста клеток osteochondro-предшественников в / в непрозрачном трикотажного титана эшафот. Кроме того, разработанные протоколы могут быть использованы для того, чтобы определить примеси, строительных лесов и проверки протоколов очистки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поверхность строительных лесов играет важную роль в его взаимодействии с окружающими тканями в естественных условиях , тем самым определяя имплантанты функциональную долговечность. Таким образом, био-совместимость помост изучен с помощью анализов в пробирке с использовани…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект частично финансируется Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) де Bundesministeriums für Wirtschaft унд Energie -KF3010902AJ4. Пошлина за публикацию была покрыта травматологическом больницы BG Тюбинген, Германия.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
