Imaging Cellviabiliteten för icke-transparenta Ställningar - Med hjälp av exempel av en ny Knitted titanimplantat
Summary
Här presenterar vi en fluorofor baserad avbildningsteknik för att upptäcka cellviabilitet på en icke-transparent titan byggnadsställning samt att upptäcka glimtar av ställnings föroreningar. Detta protokoll felsöker nackdelen av avbildning cell-cell eller cell-metallinteraktioner på icke-transparenta ställningar.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
Kronisk ryggsmärta är en multifaktoriell sjukdom. Intresset för en minimalinvasiv behandlingsalternativ för degenerativ disksjukdom har ökat sedan 1950-talet. Fram till idag, är multi-segment fusion av ryggraden den mest använda behandlingen. Sedan leder denna metod ofta begränsningar i rörlighet drabbade segmentet 1,2, utforskning av protes eran blev ett stort intresse. Betydande framsteg i total diskersättning och kärnan ersättare har blivit ett bra alternativ till behandling av kronisk ryggsmärta en. Trots den enorma framsteg, har ingen av de metoder som utvärderats kliniskt. Mindre stela nucleus implantat utgör ett lovande alternativ till total diskersättning, under förutsättning att ringen fibrosus är intakt 3,4. Men de som för närvarande finns nucleus implantat på marknaden ofta förknippas med komplikationer som förändringar i kotkroppen, förskjutning, vertikal höjd förlust av skivan och than brist på nödvändig tillhörande mekanisk styvhet 5. För att övervinna de nuvarande nackdelarna, har en ny kärna implantat tillverkade av stickade titantrådar har framgångsrikt utvecklat sex. Tack vare den unika stickad struktur har detta nyligen utvecklade byggnadsställning som visas stående biomekaniska egenskaper, t ex dämpning funktion, porstorlek, lastning kapacitet och tillförlitlighet 7. Som syftar till att testa biokompatibilitet av denna nya kärna implantat, avbildad allvarliga begränsningar i (optiska) analystekniker tillskrivs den icke-transparenta karaktär av implantatet.
För att testa biokompatibiliteten, spelar växelverkan cell metall en framträdande roll 10/8. En interaktion mellan celler och ställningen är nödvändig för stabilisering och därmed för bättre implantat integration i värdsystemet. Dock kan en ökande inväxt djup förändra de mekaniska egenskaperna hos byggnadsställningen. Syftar till att undersöktigate om ställningen ytan ger en bas för cellbindning, proliferation och differentiering eller om metallen påverkar cellviabilitet, är det viktigt att felsöka vanliga välkända problemet med avbildning celler på / i icke-transparenta och ogenomskinliga ställningar. För att övervinna denna begränsning flera fluorescerande baserade tekniker utforskades. Företag ger ett stort utbud av fluoroforer för att visualisera levande celler, cellulära avdelningar, eller till och med specifika cellulära stater 11. Fluoroforer för detta experiment valdes med hjälp av online-verktyg spektrala tittaren för att bäst passa vår fluorescerande mikroskop.
Den utvecklade strategin för analysen av det vidhäftande celler beteende på / i den icke-transparenta stickad titan byggnadsställning innebär följande: 1) fluorescerande (grönt fluorescerande protein / GFP) märkning av osteochondro-progenitorceller för att möjliggöra spårning av cellerna på byggnadsställning, 2) mätning av lönsamheten (mitochondrial aktivitet) av cellerna, och 3) att visualisera cell-cell- och cell-material interaktioner inom ställningen. Försöket har den fördelen att den lätt kan överföras till andra vidhäftande celler och andra icke-transparent eller opak byggnadsställning. Vidare kan viabilitet och inväxt mönster att övervakas under flera dagar, varför det kan användas med begränsade mängder av byggnadsställningsmaterial eller celler.
Den aktuella studien visar den framgångsrika användningen av vår nuvarande protokoll för att mäta cellviabiliteten och visualisera inväxt mönster osteochondro-progenitorceller på / i den icke-transparenta stickad titan byggnadsställning. Dessutom kan de utvecklade protokoll användas för att bestämma de ställnings föroreningar och för att kontrollera rengöringsprotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ställningen yta spelar en viktig roll i dess interaktion med omgivande vävnad in vivo därigenom bestämma implantat funktionell hållbarhet. Sålunda är biokompatibilitet av byggnadsställningen studerades med in vitro-analyser med användning av celler (SCP1 cellinje), när utstryk på byggnadsställningar.
Mikroskopi tekniker som fungerar bra med tunna och optiskt transparenta byggnadsställningar är dåligt lämpade för icke-transparenta ställningar för att stude…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet är delvis finansierat av Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Avgiften för offentliggörande har täckts av BG trauma sjukhuset Tübingen, Tyskland.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
