Viabilidad de las células de formación de imágenes en los andamios no transparentes - Usando el ejemplo de una novela de punto de titanio del implante
Summary
Aquí presentamos una técnica de imagen basada fluoróforo para detectar la viabilidad celular en un andamio de titanio no transparente, así como para detectar destellos de las impurezas del andamio. Este protocolo soluciona el inconveniente de la formación de imágenes célula-célula o célula-metálicos interacciones en los andamios no transparentes.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
dolor de espalda crónico es una enfermedad multifactorial. El interés en una opción de tratamiento mínimamente invasivo de la enfermedad degenerativa del disco ha crecido desde la década de 1950. Hasta hoy, la fusión multi-segmentaria de la columna vertebral es el tratamiento más ampliamente utilizado. Puesto que, este método conduce a menudo a las limitaciones en la movilidad del segmento afectado 1,2, la exploración de la era de la artroplastia se convirtió en un amplio interés. Avances significativos en reemplazo de disco y el núcleo reemplazo total se ha convertido en una buena alternativa para tratar el dolor de espalda crónico 1. A pesar de la enorme progreso, ninguno de los métodos ha sido clínicamente evaluado. Los implantes de núcleo menos rígidas representan una alternativa prometedora a la sustitución total de disco, a condición de que el anillo fibroso está intacto 3,4. Sin embargo, los implantes actualmente presentes en el mercado núcleo se asocian a menudo con complicaciones como cambios en el cuerpo vertebral, dislocación, la pérdida de altura vertical del disco y camisetaque es necesario falta de rigidez mecánica asociada 5. Con el fin de superar los inconvenientes actuales, una novela implante de núcleo hecha de alambres de titanio de punto se ha desarrollado con éxito 6. Debido a la estructura de punto único, este andamio recién desarrollado ha mostrado características biomecánicas distinguidos, por ejemplo, característica de amortiguación, tamaño de poro, capacidad de carga y de fiabilidad 7. Con el objetivo de probar la biocompatibilidad de este nuevo implante de núcleo, representado severas limitaciones en las técnicas de análisis (óptico) atribuidos a la naturaleza no transparente del implante.
Con el fin de probar la biocompatibilidad, la interacción de células de metal desempeña un papel destacado 8-10. Una interacción entre las células y el andamio es necesario para la estabilización y, por tanto, para la mejor integración del implante en el sistema anfitrión. Sin embargo, una profundidad creciente crecimiento interno podría alterar las propiedades mecánicas del andamio. Con el objetivo de Invesgar si la superficie del andamio proporciona una base para la fijación celular, la proliferación y la diferenciación o si el metal afecta a la viabilidad celular, es importante para solucionar el problema común bien conocida de imágenes de células sobre / en andamios no transparentes y opacas. Con el fin de superar esta limitación varios fluorescente se exploraron técnicas basadas. Empresas ofrecen una amplia gama de fluoróforos para visualizar las células vivas, los compartimentos celulares, o incluso estados celulares específicos 11. Fluoróforos para este experimento fueron seleccionados con la ayuda de la herramienta visor espectral en línea con el fin de adaptarse mejor a nuestro microscopio fluorescente.
La estrategia desarrollada para el análisis del comportamiento células adherentes sobre / en el andamio de titanio de punto no transparente implica lo siguiente: etiquetado 1) fluorescente (proteína verde fluorescente / GFP) de las células osteochondro-progenitoras para permitir el seguimiento de las células de la andamio, 2) la medición de la viabilidad (Mitoactividad mitocon-) de las células, y 3) la visualización de célula-célula y las interacciones célula-material dentro del andamio. El procedimiento tiene la ventaja de que puede ser transferido fácilmente a otras células adherentes y otros andamio no transparente u opaco. Además, la viabilidad y el patrón de crecimiento hacia el interior pueden ser monitoreados durante varios días, por lo que se puede utilizar con cantidades limitadas de material de soporte o de las células.
El presente estudio demuestra la utilización con éxito de nuestro protocolo actual para medir la viabilidad celular y visualizar el patrón de crecimiento de las células progenitoras osteochondro-sobre / en el andamio de titanio punto no transparente. Además, los protocolos desarrollados se podrían utilizar para determinar las impurezas de andamios y para comprobar los protocolos de limpieza.
Protocol
Representative Results
Discussion
La superficie de andamio juega un papel importante en su interacción con el tejido circundante in vivo determinando de ese modo los implantes durabilidad funcional. Por lo tanto, la biocompatibilidad del andamio se estudió mediante ensayos in vitro usando células (línea celular SCP1), cuando se siembran en los andamios.
técnicas de microscopía que funcionan bien con andamios fino y ópticamente transparentes, son poco adecuados para los andamios no transparentes para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proyecto está financiado en parte por Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. La tasa de publicación ha sido cubierto por el trauma del hospital BG Tübingen, Alemania.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
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