We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.
Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.
In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve 1.
With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers 2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device 4.
To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) 5. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.
여기에 설명 된 프로토콜은 방법은 MEA에 문화 SGN의 외식을하고, 세포 외 비 침습적 기록에 의해 SGN 활동을 평가이다. 이 플랫폼 우리가 최근 인공 와우 및 다른 신경 보철의 추가 구현을위한 잠재적 인 관심을 가지고, SGN를 활성화하기 위해 감소 된 에너지 요구의 결과로 새로운 자극 프로토콜 및 전극 재료의 식별을 허용 5를 개발 한 프로토콜입니다. 제시된 절차의 몇 가지주의 사항을 정확하고 재현성있는 실험의 성취에 대한 기본이다.
나선 신경절 및 기본 조직의 추가 처리를주의 깊게 해부는 특히주의가 필요합니다. 이들 실험은 5 세에서 7 일 사이 C57 / BL6 마우스를 사용하여 수행되었다. 유사한 결과가 같은 연령대의 Wistar 래트를 사용하여 수득 하였다 (데이터는 보이지 않음). 우리는 인공 뼈가 엉 여전히 부드럽고으로이 미세 해부에 가장 적합한 나이 믿습니다깨닫지 못하고 있거나 남의 쉽게 집게로 제거하고, 코르티 나선 신경절 및 기관에 대해 쉽게 수지상 프로세스 또는 SGN의 somas을 파열하지 않고 분리 할 수있다. 이전 시대에 조직이 너무 부드럽고 나중 단계에서 달팽이관의 뼈 캡슐의 경화가 해부하는 동안 조직 손상의 위험을 증가하는 동안 코르티 기관이 높은과 기회는 somas 함께 SGN를 추출 할 수 있습니다. 되어있는 SG의 적절한 분리뿐만 아니라 외식주의 절단은 매우 중요하다. 200-500 μm의 크기는 MEA 표면에의 부착을 최대화하고 신경 돌기가 자라게되는로부터 이식편에 SG의 somas 충분한 수를 갖는 이들의 범위에 있어야한다. 문화의 초기 일에 신경 영양 지원을 높이기 위해 신선한 BDNF는 매일 추가되고 코르티 기관이 공동 문화에 배치됩니다.
해부의 속도도 중요하다. 모든 단계는 조직의 열화를 최소화하기 위해 신속하고 빙냉 용액을 사용하여 수행되어야한다. 그만큼안락사와 MEA에서 이식편을 배치 사이의 시간은 10 ~ 15 분 사이 성공적인 문화를 위해 매우 중요합니다. 문화 도금 지연을 방지하기 위해, 모든 도구를 준비합니다.
미세 해부, 문화의 유지 보수 및 매체 및 장비의 준비를 포함한 모든 단계는 무균 조건 하에서 수행된다. 전자 재료 용액으로 도포 MEA 때 얼음을 해동하고, 높은 온도에서 ECM 믹스 겔로 빙냉 피펫 팁, 얼음 – 냉각 매체를 사용하는 것이 중요하다. 다자간 환경에서 외식을 배치 할 때, 첫 번째 이후에 외식을 배치, 전극 영역에 미디어를 추가 할 수 있습니다. 상기 매체는 제 2 공정에 첨가되는 경우, 이식편은 MEA로부터 의한 전단 응력을 분리하는 경향이있다. 매체의 소량은 처음 5 일 동안 배양에 적용되기 때문에, 배양 배지의 증발을 최소화해야한다. 따라서 매우 가까운 프록에 PBS를 포함하는 작은 배양 접시를 사용하여 가습 실을 작성하는 것이 좋습니다신체의 체중 측정에 성만.
여기서 설명하는 실험은 특정 전극 치수 도료 인트라 전극 거리 (포인트 2에 기재된 바와 같이 주)로 시판 MEA 전극을 사용하여 수행 하였다. 배양 조건은 특정 전극 격자 설계의 신경 커버리지를 최대화하기 위해 여기에 최적화되었다. 또한 전극 간격, 형상 및 표면의 다른 구성이 다른 코팅 또는 세포 밀도가 필요할 수있다. 이러한 단계는 고밀도 배양을 달성하기 위해 초기 문제를 요구할 수있다.
배양은 실온에서 세포 외 용액을 37 ° C에서 배양 배지로부터 전송 된 기록을 시작하기 전에, 전기 생리 학적 기록 관하여. 불안정한 녹음을 방지하기 위해, 배양이 안정 될 수 있도록 약 10 분 동안 기다린다. 문화를 자극 할 때 특히주의는 자극을 선택하는데 사용되어야한다큰 진폭 (> 3 V) 및 지속 시간은 문화가 손상 될 수 있습니다. 자극 펄스 형태 및 기간에 관한 참고 문헌 5를 참조하십시오.
데이터 수집 및 처리를 만든 하드웨어 (녹화 실, 앰프와 앰프 연결)의 경우 (재료 표, 지점 7 참조)을 사용하고, 특정 분석 프로그램이 선정되었다. 그러나, 다른 상업적 MEA의 설정 및 기타 소프트웨어 패키지는 이러한 작업뿐만 아니라 적합합니다. 우리는 이전에 3 개의 다른 시점에서 우리의 문화의 응답을 평가하고, 장기간 배양 시간 5 증가 된 활성을 나타내왔다. 여기에서 우리는 레코딩을위한 체외 18 일 좋습니다. 멸균 가습 실에서 연속 기록을 허용 MEA 시스템은 각 배양 유형에 대한 최적의 시점의 식별을 용이하게 할 수있다.
이 생물 검정의 가장 큰 단점은 t에서 높은 변형자극에 대한 반응을 보여 문화 당 전극 그는 수. 자극에 대한 반응이 속도는 주로 네 가지 요인에 따라 달라 배양에서 신경 돌기의 밀도는 신경 돌기 및 전극의 신경 돌기 또는 신경 돌기 다발의 직경, 및 전극의 임피던스 사이의 접촉. 신경 돌기 밀도에 관해서는, 적어도 두 개의 전극에 걸쳐 신경 돌기 성장만을 자극 실험에 사용될 수있다. 신경 돌기 전극 사이의 접촉은 한편으로는 전극으로부터 신경 돌기를 분리하고, 따라서 한편, 접촉이 악화하거나, 상기 신경 돌기 주변 조로부터 전극을 격리함으로써 향상시킬 수있는 주위 조직에 의존 접촉. 조직 밀도뿐만 아니라, 돌기의 크기는, 사용 된 체외 이식편 배양 조건에 의해 정의된다. 해리의 연결을 문화도 성공적으로 테스트하지만, 이러한 문화의 신경 세포 밀도는 RECO의 수가 감소의 결과로, 훨씬 낮은되었습니다rding 전극. 따라서, 세포 배양은 해결되어야 구체적인 과학적 질문에 적응되어야한다.
마지막으로, 전극의 임피던스는 주로 크기 및 전극의 표면에 주어진다. 재료,도 3에 도시 된 바와 같이 전극과 같은 신경 돌기 7-9 사이의 결합을 향상시킬 수있는 전극의 임피던스를 저하, 흑색 백금 넓은 표면을 생성.
자극의 성공율을 개선하기위한 전략 따라서, 배양 조건의 최적화, 총 전극이나 전극 밀도의 수가 증가하고, 전극면 (10)의 변조를 포함한다.
지금까지 SG 뉴런의 전기 생리 학적 특성은 패치 클램프 기술을 이용하여 수행되었다. 이 활동 전위의 세포 내 녹음과에서 세포 내 이온 전류의 상세한 분석이 가능하나의 뉴런. 여기서 우리는 동시에 다수의 뉴런의 세포 외 자극에 자발 활동 또는 응답을 분석하여 나선 신경절 뉴런의 활성 프로파일을 연구하는데 사용될 수있는 생체 외 생물학적 분석을 제시한다. 또한, 전극 및 나선 신경절 신경 세포 사이의 상호 작용을 연구 수정되거나 새로운 재료의 도포에 의해 최적화 될 수있다. 최근 자극 전극과 문화 활동의 거리 사이의 관계를 연구하기 위하여, 우리 그룹 (5)에 의해 도시 된 바와 같이 마지막으로, 여기에 도시되지 않더라도,이 플랫폼은 외부 전극과 조합하여 사용될 수 있으며, 미세 조작기에 탑재. 인공 와우 전극의 주요 기능의 흉내가 새로운 보철 장치의 설계로 이어질 수에 대한 모든 새로운 측면이 있습니다.
우리의 모델은 청각 신경 및 추가 연산의 자극의 효능을 개선하기 위해 전략을 조사 체외 도구에서 매우 유용합니다timize의 CI 기술. 기술이 숙달되면, 하나는 변수의 수의 변경에 대한 심사를 상상할 수 : A) 다른 신경 인구, b)는 다른 전극 재료 / 크기 / 임피던스의 다) 물질 독성 또는 전극 자극에 의한 독성을 테스트하는 만성 실험을 수행하는 생체 전극 배열하여보다 안전하고 효과적인 자극 프로토콜을 밝혀 줄 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 실험에 유용한 기술 도움 베른, 스위스의 대학 생리학 교실에서 루스 Rubli 감사합니다. 이 작품은 EU-FP7-NMP 프로그램 (.; – www.nanoci.org 프로젝트 NANOCI 보조금 계약없이 281,056)에 의해 부분적으로 지원되었다.
culture medium | |||
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | 24 ml (for 25 ml) |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | 250 μl (for 25 ml) |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | 250 μl (for 25 ml) |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 500 μl (for 25 ml) |
FBS | GIBCO | 10099-141 | 10% (for 25 ml) |
BDNF | R&D Systems | 248-BD-025/CF | final 5 ng/ml (for 25 ml) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
extracellular solution (pH 7.4) | |||
NaCl | 145mM | ||
KCl | 4mM | ||
MgCl2 | 1mM | ||
CaCl2 | 2mM | ||
HEPES | 5mM | ||
Na-pyruvate | 2mM | ||
Glucose | 5mM | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
blocking solution | |||
PBS | Invitrogen | 10010023 | |
BSA | Sigma | A4503-50G | 2% |
Triton X-100 | Sigma | X100 | 0.01% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunostaining solutions | |||
TuJ | R&D Systems | MAB1195 | dil 1:200 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Fluoreshild | Sigma | F6057 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
plastic/tools | |||
petri dish 35 mm | Huberlab | 7.627 102 | |
petri dish 94 mm | Huberlab | 7.633 180 | |
Dumont #5 tweezer | WPI | 14098 | |
Dumont #55 tweezer | WPI | 14099 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme | Sigma | Z273287-11KG | |
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM | Corning | 356230 | |
MEA electrodes | Qwane Biosciences | (Lausanne, Switzerland) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Labview | National Instruments | Switzerland | |
IgorPro | WaveMetrics | Lake Oswega, USA |