Спирального ганглия Нейрон эксплант и электрофизиологии на многопроцессорных электродных Массивы

Summary

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Abstract

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons.

We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

Introduction

In accordance with the World Health Organization, 360 million people worldwide suffer from hearing loss with profound consequences on professional and private life. Hearing aids can restore sensory function in moderate forms of hearing loss; however, for the most severe cases, the most effective treatment option is a prosthetic device called a cochlear implant (CI). CIs contain a linear electrode array of up to 24 electrodes, which is surgically inserted into the scala tympani of the cochlea. The electrodes directly stimulate the spiral ganglion neurons, forming the auditory nerve ¹.

With more than 300,000 devices implanted worldwide, CIs are very successful medical implants and rank among the most cost-effective procedure ever reported. Despite its success the cochlear implant still has limitations such as reduced frequency resolution compared to physiological hearing. This can lead to deficits in effective communication in groups or noisy environments, and the ability to decipher very complex sounds such as music. This reduced frequency resolution is likely due to the gap between the CI electrodes and the spiral ganglion neurons, leading to stimulation of large groups of neurons. This gap is in the range of hundreds of micrometers ^2,3. Elimination of this gap would facilitate the stimulation of smaller groups of neurons per electrode, thereby increasing frequency resolution and overall performance of the device ⁴.

To study the influence of the gap between the electrode and the neuron and the effect of various optimized stimulation protocols, we have developed an in vitro bioassay based on a non-invasive electrophysiological characterization of SGNs on multi electrode arrays (MEAs) ⁵. Additionally, MEAs can be easily modified to vary electrode shape, size, material and surface roughness, to optimize the neuron-electrode interface. The following is a step-by-step protocol to reproducibly obtain recordings from murine spiral ganglion neuron cultures and assess the dependency on the above-mentioned parameters.

Protocol

Уход за животными и эксперименты проводили в соответствии с руководящими принципами швейцарских местных властей (Amt für Landwirtschaft унд Natur суд кантона Берн, Швейцария). 1. Подготовка решения для экспериментов Приготовьте раствор для покрытия внеклеточного матрикса (ECM) (см Таблица материалов, пункт 6): Оттепель ECM смесь на льду. Развести ECM смесь в соотношении 1:10 в основной культуральной среде (без нейротрофических факторов или эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)) и хранить на льду. Подготовка питательной среды (см Таблица материалов, пункт 1): Подготовьте запас среды Neurobasal не содержащей FBS или головного мозга нейротрофического фактора (BDNF). Дополнение Neurobasal СМИ со свежими FBS (10%) и BDNF (5 нг / мл) непосредственно перед добавлением к культуре клеток. Подготовьте внеклеточный раствор (см Таблица материалов, пункт 2). 2. Мойка и Стерилизация МЭС <p cдеваха = "jove_content"> Примечание: МЭС , используемые для экспериментов , содержит 68 электродов , расположенных в виде прямоугольной сетки (рис 1E). Каждый электрод имеет размеры 40 х 40 мкм2 с шагом 200 мкм от центра до центра. Электроды изготовлены из платины. Электроды соединены с соответствующими контактами схемой из оксида индия и олова. Эта схема изолирована слоем 5 мкм SU-8. Смотрите таблицу материалов для дополнительной информации о поставщике. Другие макеты MEA могут быть пригодны для этих экспериментов. Для новых МЭС: Промыть их погружением в 70% этаноле в течение 30 сек и промывают дистиллированной водой в течение 30 сек. Работа в ламинарном потоке. Пусть MEA высохнуть в течение 30 мин в ламинарном потоке. Положите каждый MEA в индивидуальную стерильную чашку Петри (35 мм х 10 мм) и запечатать фольгой. МЭС могут храниться до использования. Для используемых МЭС: Выдержите МЭС в чашке Петри (35 мм х 10 мм), содержащего 1 мл ферментативной Solutиона (см Материалы таблицу, пункт 6) O / N на орбитальном шейкере при комнатной температуре для удаления биологического материала. Затем продолжите как в шаге 2.1. Примечание: Обращаться МЭС с осторожностью с помощью щипцов с обрезиненным советами. 3. Подготовка МЭС для экспериментов культуры Удалите предохранительную фольгу и оставить MEA в чашке Петри (35 мм х 10 мм) в течение всего эксперимента. Покрыть МЭС с раствором, приготовленным в 1.1: Используйте холодный 200 мкл кончиком пипетки (хранили при -20 ° C) до пипеткой 50 мкл раствора для покрытия к каждому MEA, покрывая всю площадь электрода. Разрешить МЭС пальто в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре. Удалите раствор для нанесения покрытия с помощью пипетки. Применить 100 мкл культуральной среды с добавлением 10% FBS и 5 нг / мл BDNF и не оставить его при комнатной температуре, пока покрытие ткани. Место 2 чашки Петри, содержащие МЭС с покрытием в большую чашку Петри (94 мм х 16 мм) и добавить третий небольшую чашку Петри, содержащую 1,5мл фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР) для увлажнения воздуха. Примечание: Добавление небольшую чашку Петри (этап 3.5), содержащий PBS имеет решающее значение, чтобы значительно уменьшить испарение культуральной среды. 4. спирального ганглия Вскрытие Примечание: Гросс рассечение может быть сделано за пределами ламинарный (шаг 4.1 до 4.4). Для тонкой рассечение стерильных условиях (ламинарный поток капот) являются обязательными (начиная с шага 4.5). Эвтаназии животных (5-7 день старых мышей) путем декапитации без предварительного анестезии. Стерилизовать голову опрыскиванием 70% -ным этанолом. Держа голову, разорвите соединение между кожей и черепом с острым / острым ножницами вдоль сагиттальной линии. Вырезать череп сагиттальной и извлечь мозг, используя острый / тупой стороной ножниц. Нарезать височных костей из черепа и поместить те, в чашку Петри, содержащую стерильный лед холодный Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS). Использование dissecционный микроскоп, рассекают барабанной буллу с использованием тонких щипцов и изолировать внутреннее ухо. Удалите кости улитке, с использованием тонких щипцов. Удалите винтовую связки и полоской vascularis (SV) вместе, удерживая пинцетом базальную часть спирального ганглия (SG) и SV и медленно разматывать SV от основания -в-вершине Изолировать орган Корти (OC), СГ и Modiolus (рис 1A – C) Отделить OC от SG и Modiolus, удерживая пинцетом базальную часть SG и OC и медленно разматывать OC от основанием к вершине. Вырежьте боковые эксплантов ( от 200 до 500 мкм в диаметре) из спирального ганглия все еще прикреплены к Modiolus (рис 1D) с помощью щипцов и микро скальпелем. 5. спирального ганглия эксплант на МЭС Поместите два спиральных эксплантов ганглиев рядом с электродами на СМЭ предварительно приготовленной с 100 мкл культуральной среды. Поместите орган Корти примерно 5 мм от площади электрода. Используйте пинцет, чтобы прикрепить эксплантов и орган Корти на СМЭ, избегая при этом повреждения ткани. Поместите МЭС осторожно в инкубатор и культуры при 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, визуально проверить, что эксплантаты приложили к СМЭ. Примечание: Если эксплантаты не прилагается O / N, они редко делают это в течение ближайших дней. OC помещается рядом с культурой для трофической / нейротрофического поддержки. Добавляют 100 мкл культуральной среды, содержащей 10% FBS и BDNF в день в течение 5 последовательных дней. На 6-й день добавляют 2 мл культуральной среды, содержащей 10% FBS и 5 нг / мл BDNF и культуры ткани в течение еще 13 дней. 6. Электрофизиологические записи по расследованию спонтанным и электродный Стимуляция Зависимая активность Вымойте MEA культуру с внеклеточной таклюция, полученного на стадии 1.3, при комнатной температуре. Сухие контакты с тканью и установите MEA на установке MEA. Примечание: Чтобы сохранить культуру влажной во время монтажа, добавить небольшую каплю внеклеточного раствора к культуре. Добавьте 300 мкл раствора внеклеточной и ждать в течение 10 минут перед записью, чтобы позволить системе стабилизации. Запись спонтанной активности в течение 2 мин со всех электродов, нажав на кнопку записи программного обеспечения / приобретения и идентификации записи электродов. MEA электрод стимуляции: Выберите амплитуду / длительность / форму стимула на соответствующее программное обеспечение и применить к нескольким электродам последовательно , как описано 13. Выберите электроды, основанные на них, показывающие спонтанную активность (как на этапе 6.4). Запись от всех остальных электродов. Для исключения стимуляции артефакт, стимулируют из того же электрода 10 раз. Если культура отвечает по крайней мере, 8 из 10 раз, то можно предположить, какПоложительный ответ на электрод индуцированной стимуляции. Чтобы определить фоновый шум, применять тетродотоксин (ТТХ) к cultureat в концентрации 1 мкМ, чтобы блокировать напряжения натриевых каналов и запись в течение 2 мин. Используйте эту функцию для выполнения шипа обнаружения (7.1 и 7.2). 7. Анализ данных Примечание: анализ данных был ранее описан подробно в 6 и 5. Для специфики на программное обеспечение , используемые в данном исследовании см Материалы Таблица, пункт 7. С помощью соответствующего программного обеспечения обнаружения спонтанной активности для каждого электрода, использующего детектор на основе стандартных отклонений и последующем дискриминатора. Эта процедура описана в 6. Активность выступает как быстрые броски напряжения (<5 мс). Выберите пороговое значение, что приводит к отсутствию активности при анализе ТТХ обработанного samples.adapt значение для каждого эксперимента, чтобы различать ложных positivе и ложноотрицательных обнаружений. С помощью соответствующего программного обеспечения наблюдения за обнаруженной нейронную активность электрода в виде растрового сюжета соответствии со стандартными процедурами (смотри рисунок 2a – c). Определить показать общую сетевую путем суммирования всех обнаруженных событий пределах скользящего окна 10 мс, смещенные с шагом 1 мс. Обнаружение стимуляции индуцированной отображения необработанных данных использованием анализа. отдельные шипы отсутствует вручную. Одиночные появляются как быстрые броски напряжения, возникающие после артефакта (стрелка головы на рисунке 2Е). Пример показан 2Е. В зависимости от анализировать количество реагирующих электродов, , необходимое достижения ответа, потенциала действия электродах других интересующих параметров 5. 8. tissue Фиксирование Иммunohistochemistry Примечание: Процесс окрашивания уничтожит МЭС. См таблицу материалов (пункт 4) реагентов. Сразу же записи мыть культур температурой 37 ° теплым pbs три раза. Выбросите применить 4% параформальдегида (pfa) (в pbs), предварительно нагретый до течение мин. ВНИМАНИЕ: pfa является токсичным. Работа химической капюшон соответствующей защитой сброшенных решения руководящими принципами. Промыть Культуру трижды блок 2% -ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) (0,01% Тритон-x100) 2 ч. Добавить первого антитела (анти-βiii тубулине, туй антитело), ​​разведенного (2% bsa 0,01% triton-x100) оставить o >

Representative Results

На рисунке 1 приведена процедура для изоляции тканей, подготовки и культуры на СМЭ. Мы покажем последовательные стадии рассечения тканей , чтобы изолировать спирального ганглия (SG) из сенсорного эпителия органа Корти (OC) и полоской vascularis (SV) и прилагаемые к нему спиральной связки (Рисунок 1 – C). Спирального ганглия эксплантаты (3-4 числа) срезают с микро-ножниц из ганглия , как схематически показано на рис 1D и размещены на MEA (рис 1E), поверх электродных занимаемой площади (2,2 мм 2). ОК размещается в непосредственной близости, за пределами поверхности электрода. Рост культуры можно наблюдать во времени (рис 1G). Принципиальная схема протокола показан на рисунке 1F. Электрофизиологические активность может быть обнаружена через 6 дней культуры, которые увеличивают с длительным временем культивирования. Мы гecommend оценки 18 -й день культуры , которые производят значительно более высокие количества регистрирующих электродов по сравнению с более ранними временными точками 5. Рисунок 1. Клеточные культуры подготовки. (A) свеже расчлененный мыши внутреннее ухо. Белая пунктирная линия указывает местоположение улитке, черная пунктирная линия указывает на вестибулярный область. (Б) Мышь внутреннее ухо после снятия кохлеарного костистых стенки. Кохлеарные повороты обозначены белыми пунктирными линиями. (C) спирального ганглия (SG) и Modiolus, орган Корти (OC) и полоской vascularis (SV) и спиральные связок показаны после рассечения. (D) Схема SG и OC Вскрытие и подготовка SG эксплантов {адаптировано из фигурного 5 с одобрения от издателя}. (Е) Иллюстрация многозвенных массива электродов , используемых в данном исследовании. ПерешифроватьЭлектроды организованы в виде прямоугольной сетки в центре и занимают площадь 2,2 мм 2. 4 заземляющих электродов и боковые контакты иллюстрированы. (F) Схема протокола культуры. Записи выполняются в день 18. (G) репрезентативные изображений (светлое поле изображений) и схем SG эксплантов на MEA мониторинг в культуре в 1 -й день, 6 и 18. Масштабные полоски = 400 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура. Спонтанная активность может быть обнаружена на СМЭ и показан в виде растрового участка, на котором каждая линия сюжета представляет обнаруженный всплеск. Характерным примером показывающий спонтанную активность , обнаруженный из нескольких электродов (разных цветов на графиках) показан (фиг 2А, 2В и 2С). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = "1"> Кроме того, MEA электроды могут быть использованы, чтобы стимулировать культуру. Характерным примером , показывающий двухфазный импульс , используемый для стимуляции (рис 2D), 5 ответившие электроды (красные следы) и не отвечающие электроды (синие следы) показан на рисунке 2Е. Для этих экспериментов один электрод был использован для стимуляции и всех остальных электродов для записи. Одиночные потенциалы действия появились 1 мс после стимуляции артефакта (черная стрелка головы). МЭУ может быть иммунологически в конце процедуры с целью оценки охвата нейрональных процессов по площади электрода. Электрод , отмеченная зеленым на рисунке 2F использовался для стимуляции, а электроды , указанные в красном цвете были использованы для записи ответов (Рисунок 2E). Рисунок 2. Запись данных на СМЭ. (A </Сильный>) Следы оригинальных записей шести из 63 электродов, показывающих спонтанную активность. (B) Растр участок из шести электродов фигуре 2А после обнаружения пика. Каждый столбик представляет собой один потенциал действия. (С) Растровое участок , включая все электроды (как в А и Б) Активность фиксируется от 63 электродов (каналов номер 0-63) в течение 2 мин. (D) двухфазный стимул общей продолжительностью 80 мкс и амплитудой 80 мкА использовали для стимуляции культуры от одного электрода (E58 на рисунке 2F). (E) Представитель пример необработанных данных , полученных следов после стимуляции от электрода 58 , показывающий потенциалы действия (красные следы) или без ответов (синие следы) после стимуляции (черная стрелка-голова). (F) Спиральный культура ганглий на MEA иммуноокрашиванию для нейронального маркера туй (зеленого цвета) в конце эксперимента , чтобы визуализировать нейро NAL покрытие площади электрода {фигура заимствована из 5 с согласия издателя}. Электрод 58 используется для стимуляции обозначается зеленым цветом, ответившие электроды обозначены красным цветом. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. И, наконец, установка MEA позволяет для изучения возможной модификации поверхности электрода, что может привести к увеличению чувствительности записи. Два коммерчески доступные MEA электроды были использованы в данном исследовании с двумя различными платиновых поверхностей: Серый платины (Серый Pt), состоящий из 150 нм толщиной слоя Pt (сопротивление: 400 кОм / 1 КГц) и Black Platinum, (черный, Pt), полученный методом электрохимического осаждения Pt в конце микро-процесса изготовления (импеданс: 20 кОм / 1 кГц). См материалы таблица (пункт 6) для деталей. лор "ВОК: Keep-together.within-страницы =" 1 "> Шесть независимых экспериментов MEA были выполнены по типу электрода MEA Черный Pt позволяет обнаруживать нейрональной активности на более высоком числе электродов на MEA (фиг.3А) и сокращение. стимул амплитуда необходимы для получения ответа (рис 3б). Мы анализировали на 30-35 независимых пар электродов, в 6 различных опытах, пороговый ток , необходимый для достижения ответа. электроды черные Pt показали намного лучшие результаты, показывающий порог 31,09 мкА +/- 2,4 по сравнению с электродами Серый Pt 47,57 μ A +/- 1,97. Рисунок 3. Сравнение Grey против электродов Black Pt. Два типа электродов (серый и черный Pt), сравнивали бок о бок с использованием 12 независимых МЭС культуры, 6 на каждого типа MEA. (A) Общее число повторноствующие электроды на эксперимента. (В) Амплитудный порог , чтобы вызвать реакцию, измеренная с помощью независимых 30-35 пар электродов в 6 независимых экспериментах MEA показано. Данные представлены в виде среднее +/- SD. (Т – критерий Стьюдента р <0,001) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Протокол, описанный здесь, показывает, как культура SGN эксплантов на СМЭ и оценить активность SGN внеклеточными неинвазивных записей. Эта платформа и протокол мы недавно разработали ⁵ позволяют для идентификации новых протоколов стимуляции и электродных материалов что приводит к уменьшению потребности в энергии для активации SGN, с потенциальный интерес для дальнейшей реализации кохлеарных имплантатов и других нейро-протезирования. Некоторые меры предосторожности, в представленном порядке имеют основополагающее значение для выполнения точных и воспроизводимых экспериментов.

Тщательное рассечение спирального ганглия и дальнейшей обработки первичной ткани требует особой осторожности. Эти эксперименты были проведены с использованием мышей C57 / НД6 от 5 до 7 дней. Аналогичные результаты были получены с использованием крыс линии Вистар в той же возрастной группы, (данные не показаны). Мы считаем, что это лучший возраст для тонкой рассечение как кохлеарный кости еще мягкие антельное для легкого удаления пинцетом и спирального ганглия и органа Корти могут быть легко отделены без разрывания дендритных процессов или SGN Somas. В более раннем возрасте ткань слишком мягкая и шансы сорвать SGN СОСМ вместе с органом Корти выше, в то время как на более поздних стадиях, упрочнение костной капсулы улитке увеличивает риск повреждения тканей во время рассечения. Правильная изоляция SG, а также осторожность резка эксплантов имеет решающее значение. Они должны быть в диапазоне 200-500 мкм, чтобы максимизировать прикрепление к поверхности СМЭ и иметь достаточное количество SG РРОС в эксплантатах, из которого невриты будет Regrow. Для увеличения нейротрофический поддержки в первые дни культуры, свежий BDNF добавляется ежедневно, и орган Корти находится в совместной культуре.

Скорость рассечения также имеет важное значение. Все шаги должны быть выполнены быстро и с использованием льда холодных растворов для того, чтобы свести к минимуму ухудшение ткани.время между эвтаназией и размещения эксплантов на МЭС должна быть между 10-15 мин и имеет решающее значение для успешных культур. Есть все инструменты готовы, чтобы избежать задержек в культуре обшивкой.

Все шаги, в том числе тонкой рассечение, поддержание культуры и подготовки среды и оборудования выполняются в стерильных условиях. При нанесении покрытия на MEA с решением ECM важно, чтобы растопить его на льду и использовать ледяное наконечники пипеток и прохладительных среду в качестве гелей ЕСМ смеси при более высоких температурах. При размещении эксплантов на МЭС, сначала добавьте среду в электродных областей, затем поместите эксплантов. Если среда добавляется на второй стадии, эксплантов имеет тенденцию отслаиваться из СМЭ из-за напряжения сдвига. Поскольку небольшие объемы среды, применяются к культуре в первые 5 дней, испарение культуральной среды должна быть сведена к минимуму. Поэтому настоятельно рекомендуется создать увлажненной камере, используя небольшие чашки Петри, содержащие PBS в тесном Proximности к МЭС.

Эксперименты, описанные здесь, были выполнены с использованием коммерчески доступных электродов МЭС с конкретными размерами электродов, облицовочных материалов и внутри- расстояние между электродами (как описано в пункте 2, примечание). Условия культивирования были оптимизированы здесь для того, чтобы максимально увеличить нейронную охват конкретной конструкции электрода сетки. Вполне возможно, что другие конфигурации электродов, распорных геометрии и поверхностей могут требовать различных покрытий или плотности клеток. Эти шаги могут потребовать первоначального поиска неисправностей для достижения культур с высокой плотностью.

Что касается Электрофизиологические записи, перед началом записи культура передается из культуральной среды при 37 ° С в внеклеточный раствор при комнатной температуре. Для того чтобы избежать нестабильных записей, подождите примерно 10 мин, чтобы позволить культуру стабилизироваться. При стимуляции культуры, особую осторожность следует использовать при выборе стимулаа большие амплитуды (> 3 В) и длительности может привести к повреждению культуры. Для справки относительно стимуляции формы и длительности импульса см ⁵ ссылку.

Для сбора и обработки данных домашнего аппаратного обеспечения (записи камеры, подключения к усилителям и усилители) , были использованы и были выбраны конкретные программы анализа (см Таблица материалов, пункт 7). Тем не менее, другие коммерческие MEA расстановок и другие программные пакеты подходят также и для этих операций. Ранее мы оценивали ответы наших культур в 3 -х различных временных точках и показал повышенную активность со временем продленной культуре ^5. Здесь мы предлагаем 18 дней в пробирке для записей. MEA системы, позволяющие для непрерывной записи в стерильных увлажненных камерах, могли бы способствовать выявлению оптимальных временных точек для каждого типа культуры.

Основным недостатком этого биопроб является высокая изменчивость тон число электродов в культуре, которые показывают ответы на стимуляцию. Эта скорость реакции на стимуляцию, главным образом, зависит от четырех факторов: плотность нейритов в культуре, контакты между невритов и электродами, диаметра невритов или невриты пучков, а импеданс электродов. Что касается плотности аксонов, только невриты, которые растут в течение, по меньшей мере, два электрода могут быть использованы для проведения экспериментов стимуляции. Контакт между невритов и электродов зависит от окружающих тканей, которые могут с одной стороны, изолирования невриты от электрода, и тем самым ухудшить контакт, или, с другой стороны, изолирования невриты и электрод из окружающей ванны и таким образом улучшить контакт. Плотность ткани, а также размер аксонов, определяются эксплантов, используемой и условий культивирования. Диссоциированные нейрональной культуре также были успешно испытаны, но плотности нейронов в этих культурах значительно ниже, что приводит к уменьшению количества RECOВИДЕОЗАПИСЬ электроды. Поэтому клеточная культура должна быть адаптирована к конкретному научному вопросу предстоит решить.

И, наконец, полное сопротивление электродов в основном определяется размером и поверхностью электродов. Материалы, создающие большую поверхность , такие как черная платина, как показано на рисунке 3, уменьшая сопротивление электродов может также улучшить сцепление между электродами и невритов ^7-9.

Поэтому стратегии для улучшения показателя успешности стимуляции включают оптимизацию условий культивирования, увеличение числа общих электродов или плотности электродов и модуляции поверхности электрода ^10.

До сих пор, электрофизиологические характеристики SG нейронов были выполнены с использованием методов локальной фиксации. Это позволяет внутриклеточных записи потенциалов действия и детального анализа внутриклеточных ионных токов отодиночные нейроны. Здесь мы представим биопробы в пробирке , который может быть использован для изучения профилей активности нейронов спирального ганглия путем анализа спонтанной активности или ответы на внеклеточный стимуляцию многих нейронов одновременно. Кроме того, взаимодействие между электродом и нейронов спирального ганглия могут быть изучены и оптимизированы путем применения модифицированных или новых материалов. И, наконец, даже если это не показано здесь, эта платформа может быть использована в сочетании с внешним электродом, установленный на микроманипулятор , как недавно было показано нашей группой ^5, с целью изучения взаимосвязи между расстоянием от раздражающего электрода и культуры деятельности. Все эти новые аспекты позволяют Подражание ключевых особенностей кохлеарных электродов имплантата может привести к разработке новых протезах.

Наша модель является очень полезным инструментом в пробирке для исследования стратегий для повышения эффективности стимуляции слуховых нейронов и дальнейшего орtimize технологии CI. После того, как эта техника освоена, можно представить себе скрининг для модификации ряда переменных: а) различные нейронные популяции, б) различные электродные материалы / размер / импедансов с) выполнять хронические эксперименты для проверки материала токсичности или электрода стимуляции индуцированной токсичности, которая могли бы пролить свет на более безопасные и эффективные протоколы стимуляции массивов электродов в естественных условиях.

Materials

culture medium
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049	24 ml (for 25 ml)
HEPES	Invitrogen	15630-080	250 μl (for 25 ml)
Glutamax	Invitrogen	35050-061	250 μl (for 25 ml)
B27	Invitrogen	17504-044	500 μl (for 25 ml)
FBS	GIBCO	10099-141	10% (for 25 ml)
BDNF	R&D Systems	248-BD-025/CF	final 5 ng/ml (for 25 ml)
Name	Company	Catalog Number	Comments
extracellular solution (pH 7.4)
NaCl			145mM
KCl			4mM
MgCl2			1mM
CaCl2			2mM
HEPES			5mM
Na-pyruvate			2mM
Glucose			5mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
blocking solution
PBS	Invitrogen	10010023
BSA	Sigma	A4503-50G	2%
Triton X-100	Sigma	X100	0.01%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
TuJ	R&D Systems	MAB1195	dil 1:200
DAPI	Sigma	D9542
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Fluoreshild	Sigma	F6057
Name	Company	Catalog Number	Comments
plastic/tools
petri dish 35 mm	Huberlab	7.627 102
petri dish 94 mm	Huberlab	7.633 180
Dumont #5 tweezer	WPI	14098
Dumont #55 tweezer	WPI	14099
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Enzymatic solution: Terg-a-Zyme	Sigma	Z273287-11KG
Extracellular Matrix (ECM) mix: Matrigel TM	Corning	356230
MEA electrodes	Qwane Biosciences		(Lausanne, Switzerland)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Labview	National Instruments		Switzerland
IgorPro	WaveMetrics		Lake Oswega, USA