निर्माण और एक मधुमेह घाव मॉडल में एक वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASC) शीट के ट्रांसप्लांटेशन
Summary
वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs) आसानी से अलग कर रहे हैं और सामान्य चूहों की चर्बी से काटा जाता है। ए एस सी चादरें इंजीनियरिंग सेल शीट का उपयोग करके बनाया जा सकता है और मधुमेह फैटी चूहों पूर्ण-मोटाई का प्रदर्शन दोष उजागर हड्डी के साथ त्वचा और फिर कृत्रिम त्वचा की एक bilayer के साथ कवर किया Zucker में प्रत्यारोपित किया जा कर सकते हैं।
Abstract
कृत्रिम त्वचा नैदानिक अभ्यास में काफी चिकित्सीय परिणाम हासिल किया है। हालांकि, कृत्रिम त्वचा उपचार अवस्र्द्ध रक्त प्रवाह के साथ या बड़े घाव के साथ मधुमेह रोगियों में घाव के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है। सेल आधारित चिकित्सा मधुमेह अल्सर के उपचार के लिए एक नई तकनीक के रूप में दिखाई देते हैं, और सेल-पत्रक इंजीनियरिंग सेल ट्रांसप्लांटेशन की प्रभावकारिता में सुधार हुआ है। रिपोर्टों की एक संख्या का सुझाव दिया है कि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs), एक प्रकारको mesenchymal stromal सेल (एमएससी), वसा ऊतकों और अन्य ऊतकों से MSCs के लिए की तुलना में जब संग्रह के लिए उनकी पहुंच में उनके रिश्तेदार बहुतायत के कारण चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शन है। इसलिए, ASCs चिकित्सकीय प्रयोग के लिए स्टेम कोशिकाओं का एक अच्छा स्रोत होना दिखाई देते हैं। इस अध्ययन में, ए एस सी पत्रक सामान्य लुईस चूहों की epididymal वसा वसा से सफलतापूर्वक तापमान उत्तरदायी संस्कृति व्यंजन और सामान्य संस्कृति ascorbic एसिड युक्त माध्यम का उपयोग कर बनाया गया था। ए एस सी चादर Zucker मधुमेह फैटी (ZDF) चूहों में प्रत्यारोपित किया गया, एक चूहा मॉडल टाइप 2 मधुमेह और मोटापा, कि कम प्रदर्शन के घाव। एक घाव पोस्टीरियर कपाल सतह पर बनाया गया था, ए एस सी चादरें घाव में प्रत्यारोपित किया गया, और एक bilayer कृत्रिम त्वचा पत्रकों को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ए एस सी चादरें प्राप्त ZDF चूहों बेहतर ASC पत्रकों का ट्रांसप्लांटेशन बिना ZDF चूहों से घाव था। ए एस सी चादरें एक नम घाव पर्यावरण के रखरखाव की आवश्यकता के शुष्क परिस्थितियों के प्रति संवेदनशील होते हैं, क्योंकि इस दृष्टिकोण तक ही सीमित था। इसलिए, कृत्रिम त्वचा सुखाने को रोकने के लिए ए एस सी चादर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कृत्रिम त्वचा के साथ संयोजन में ए एस सी पत्रकों की निर्वाचित प्रत्यारोपण भी अन्य असभ्य अल्सर या जलता है, उन परिधीय धमनी रोग और कोलेजन रोग, के साथ मनाया के रूप में लागू किया जा सकता है और जो कुपोषित हैं या स्टेरॉयड का उपयोग कर रहे हैं रोगियों के लिए प्रशासित किया जा सकता है। इस प्रकार, इस उपचार घाव मधुमेह उपचार के लिए चिकित्सीय विकल्प में सुधार की दिशा में पहला कदम हो सकता है।
Introduction
मधुमेह के रोगियों की आबादी दुनिया भर में बढ़ रही है और 20151में 400 मिलियन तक पहुँच गया; एक अनुमान के अनुसार 15-25% मधुमेह के रोगियों के एक निचले-किनारा मधुमेह अल्सर2की प्रगति से खतरे में हैं। निचले-किनारा मधुमेह अल्सर असभ्य हैं और पूरी वसूली के बाद पुनर्वास प्रशिक्षण के साथ एक लंबे समय तक चिकित्सीय अवधि की आवश्यकता हो सकती है। एक लंबे उपचार की अवधि अक्सर रोगी जीवन की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम है। इस प्रकार, नई चिकित्सा कि कमी या उत्तेजना रोकने मधुमेह घाव के उपचार के लिए विकसित किया जाना चाहिए। मधुमेह घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए, हम अनुकूलित जो व्यावहारिक नैदानिक स्थिति mimics, मधुमेह अल्सर घाव भरने में एक मॉडल चूहों, और चिकित्सा घाव चाहे वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASC) शीट्स सेल शीट इंजीनियरिंग का प्रयोग रोपाई त्वरित मूल्यांकन किया।
उनके आत्म-नवीकरण क्षमता, उनके प्रतिरक्षण निश्चायक प्रभाव और उनके विभिन्न सेल प्रजातियों3में अंतर करने की क्षमता के कारण घाव भरने में तेजी के लिए एक उत्कृष्ट क्षमता mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) दर्शाते हैं। ASCs वसा ऊतकों से ली गई एमएससी का एक प्रकार हैं, और वे उनके संभावित angiogenic और paracrine गतिविधि4,5सहित अन्य ऊतकों से व्युत्पन्न MSCs पर कई लाभ दिखा रहे। वसा ऊतकों में मानव शरीर अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में है, और इसकी पहुंच न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं का उपयोग कर संग्रह के लिए अनुमति देता है। इसलिए, ASCs प्रयोगात्मक घाव अनुप्रयोगों6,7के लिए इस्तेमाल किया गया है।
पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि एकल-कक्ष एमएससी निलंबन का डायरेक्ट इंजेक्शन घाव आसपास के क्षेत्रों में8,9घाव में तेजी लाने कर सकते हैं। हालांकि, एकल-कक्ष निलंबन के इंजेक्शन के बाद मधुमेह अल्सर मॉडल में घाव भरने की गति का रिपोर्ट के बावजूद, घाव स्थल पर प्रतिरोपित कोशिकाओं के अस्तित्व के समय स्पष्ट नहीं है।
इस अध्ययन में, हम सेल शीट इंजीनियरिंग तापमान उत्तरदायी संस्कृति बर्तन का उपयोग कर लागू किया गया। ये व्यंजन तापमान उत्तरदायी बहुलक N– isopropylacrylamide covalently पर उनकी सतह10से बाउंड है। Grafted बहुलक परत करने के लिए कक्ष के तापमान नियंत्रित आसंजन या संस्कृति डिश की सतह से अलगाव के लिए अनुमति देता है। पकवान की सतह 37 ° C, कोशिकाओं अनायास अलग सतह से जब यह कम तापमान 32 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोफिलिक हो जाता है, जबकि कोशिकाओं का पालन और पैदा करना, करने के लिए अनुमति देने पर hydrophobic हो जाता है सुसंस्कृत कोशिकाओं बरकरार करने के लिए-सेल के जंक्शनों और extracellular मैट्रिक्स (ECMs) के साथ एक निरंतर सेल शीट के रूप में बस के तापमान को कम करने के द्वारा काटा जा सकता है; इस प्रकार, proteolytic एंजाइमों कि ECM, trypsin, जैसे नुकसान आवश्यक11नहीं हैं। इसलिए, सेल-पत्रक इंजीनियरिंग सेल करने के लिए कनेक्शन की रक्षा और सेल प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता में सुधार कर सकते हैं।
इसके अलावा, सेल-पत्रक ट्रांसप्लांटेशन सेल इंजेक्शन12करने के लिए की तुलना में जब कक्ष से बचने की दर बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल में, Zucker मधुमेह वसायुक्त (ZDF) चूहों विलंबित घाव भरने के साथ एक टाइप 2 मधुमेह और मोटापे के मॉडल के रूप में चयन किया गया था। ZDF चूहों अनायास मोटापा लगभग 4 सप्ताह में विकसित। वे तब उम्र, पर जो बात वे hyperglycemia इंसुलिन प्रतिरोध, dyslipidemia और hypertriglyceridemia13के साथ जुड़े प्रदर्शन के 8 और 12 सप्ताह के बीच मोटापे के साथ टाइप 2 मधुमेह विकसित। विलंबित घाव चिकित्सा, रक्त का प्रवाह कम परिधीय रक्त वाहिकाओं, और मधुमेही नेफ्रोपैथी में14,15,16मनाया भी कर रहे हैं। इसके अलावा, ZDF चूहों का अध्ययन असभ्य त्वचीय अल्सर, मधुमेह अल्सर जैसे की चिकित्सा के लिए एक उपयुक्त मॉडल हो सकता है।
मनुष्य और कृन्तकों के बीच मतभेद घाव तंत्र में त्वचा में संरचनात्मक अंतर के साथ जुड़े रहे हैं। घाव भरने में मनुष्य पुनः epithelialization और कणिकायन ऊतक के गठन पर आधारित है, जबकि सामान्य चूहों में घाव पर घाव संकुचन, आधारित है। सामान्यतया, घाव कृंतक मॉडल में इस्तेमाल किया splinting घाव संकुचन को कम करने में मदद करता है और nondiabetic चूहों में घाव लगभग पूरी तरह से संकुचन द्वारा बंद हो जाती हैं, हालांकि कणिकायन ऊतक17, क्रमिक संरचना के लिए अनुमति देता है। हालांकि, मधुमेह संकुचन घाव ZDF में चूहों बिगड़ा हुआ है, और मुख्य रूप से घाव होता है के माध्यम से फिर से epithelialization और कणिकायन ऊतक के गठन; इस प्रकार, इस प्रक्रिया14मानव घाव करने के लिए और अधिक समान है।
मधुमेह घाव debridement अक्सर का सामना कर रहे हैं करने के बाद चिकित्सकीय उजागर हड्डी के साथ। पिछले अध्ययनों 12 मिमी व्यास पूर्ण-मोटाई त्वचा के घाव athymic नग्न चूहों18,19 की पीठ पर और सामान्य चूहों20की पीठ पर 10 मिमी व्यास पूर्ण-मोटाई त्वचा के घाव की जांच की है। गंभीर मधुमेह घाव के लिए एक नैदानिक मॉडल विकसित करने के लिए, बड़े 15 x 10 मिमी (2) पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष के साथ हड्डी से अवगत कराया और बिना पेरियोस्टेयम बनाए गए थे, पहले वर्णित किए गए21, टाइप 2 मधुमेह और मोटापे के साथ चूहों में के रूप में।
सामान्य लुईस चूहों के ASCs से चूहा ASC (rASC) शीट्स ASC पत्रकों के निर्वाचित प्रत्यारोपण के माध्यम से बनाए गए थे। क्योंकि मधुमेह के रोगियों के अल्सर के साथ अक्सर गंभीर मधुमेह की जटिलताओं, अनियंत्रित उच्च रक्त शर्करा का स्तर और उच्च शरीर द्रव्यमान सूचकांक है, और कि इन रोगियों से वसा ऊतक प्राप्त करने की कठिनाई में वृद्धि इन जटिलताओं के कारण घाव विकारों जैसे प्रदर्शन नैदानिक अभ्यास में, autologous प्रत्यारोपण unfeasible है। इसके अलावा, मधुमेह प्रदर्शनी के साथ पशुओं से ASCs और गुण बदल दिया समारोह22बिगड़ा। इसलिए, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल rASC पत्रक सामान्य चूहों से निर्वाचित प्रत्यारोपण और कृत्रिम त्वचा के आवेदन मधुमेह चूहों के लिए का वर्णन करता है।
Bilayer कृत्रिम त्वचा में इस प्रोटोकॉल का उपयोग घाव के सहज संकुचन से बचाता है, संयोजी ऊतक के एक नए मैट्रिक्स के संश्लेषण को बढ़ावा देता है, और सच dermis23के जैसा। इस प्रोटोकॉल में, कृत्रिम त्वचा एक rASC पत्रक पर नहीं रखे और घाव संकुचन या ढीले चूहा त्वचा से जिसके परिणामस्वरूप इज़ाफ़ा को रोकने के लिए नायलॉन धागे के साथ ठीक किया गया है। इसके अलावा, कृत्रिम त्वचा ASC पत्रक के लिए एक तीन आयामी रूपरेखा प्रदान करता है, प्रतिरोपित ए एस सी चादरें और घावों के लिए एक नम वातावरण बनाए रखता है, और घाव संक्रमण और बाहरी ताकतों से रक्षा करता है। अंत में, एक गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग घाव पर यह बाहरी प्रभाव से बचाने के लिए, एक नम घाव वातावरण बनाए रखने और exudate को अवशोषित करने के लिए रखा गया है।
एक rASC पत्रक पतली, लचीली, और आकार के अनुसार स्थिर है, और प्राप्तकर्ता साइटों, एक धड़कन दिल24जैसे चलती करने के लिए पालन कर सकते हैं। सेल-पत्रक इंजीनियरिंग विभिन्न ऊतकों के पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है और उपचारात्मक प्रभाव25,26. उत्पन्न कर सकते हैं ए एस सी चादरें कि नैदानिक चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शन घाव के कई प्रकार के उपचार में तेजी लाने सकता है। इसके अलावा, ए एस सी चादरें उपयोग कृत्रिम त्वचा, के साथ संयुक्त, allogeneic ट्रांसप्लांटेशन असभ्य अल्सर या जलता है, जैसे उन परिधीय धमनी रोग या कोलेजन रोग, में मनाया के उपचार के लिए लागू किया जा सकता है या वे रोगियों जो कुपोषित हैं या स्टेरॉयड का उपयोग कर रहे हैं करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण ASCs रोपाई की क्षमता बढ़ जाती है। घाव ZDF मूषक मॉडल जो मानव घाव घाव भरने की प्रक्रिया के जैसा होता है और एक छोटे आकार प्रायोगिक पशुओं में नैदानिक स्थिति mimics एक गंभीर घाव की स्थिति पैदा करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफलतापूर्वक एक rASC पत्रक संवर्धन के सबसे महत्वपूर्ण चरण निम्नानुसार हैं: 1) तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान उत्तरदायी संस्कृति व्यंजन पर संवर्धन के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए। एक rASC शीट का निर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डॉ Yukiko Koga विभाग के प्लास्टिक और पुनर्निर्माण सर्जरी, Juntendo यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, व्यावहारिक सलाह प्रदान करने के लिए धन्यवाद। हम भी श्री Hidekazu Murata मधुमेह केंद्र के टोक्यो महिलाओं की चिकित्सा यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद। इस अध्ययन के नवाचार केन्द्रों के निर्माण द्वारा प्रोग्राम के लिए उन्नत अंतःविषय अनुसंधान क्षेत्रों विकासशील नवाचार प्रणाली “सेल शीट ऊतक इंजीनियरिंग केंद्र (CSTEC)” के लिए परियोजना के शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEXT) जापान के से समर्थित किया गया था।
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
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