إنشاء وزرع للخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) ورقة في نموذج التئام السكري
Summary
هي عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (الخزفية) وتحصد من الدهون الفئران العادية بسهولة. أوراق الرابطة يمكن إنشاؤها باستخدام هندسة الخلايا–ورقة ويمكن زرعها في زوكر الجرذان الدهنية السكري العارضة كامل-سمك الجلد العيوب مع العظام مكشوفة ومغطاة ثم بيلايير جلد الاصطناعي.
Abstract
الجلد الاصطناعي حققت نتائج علاجية كبيرة في الممارسة السريرية. ومع ذلك، قد يطول علاجات البشرة الاصطناعية للجروح في مرضى السكري مع تدفق الدم إعاقة أو الجروح الكبيرة. ظهرت العلاجات المستندة إلى الخلية كتقنية جديدة لعلاج قرح السكري، وهندسة خلية ورقة تحسنت فعالية زرع الخلايا. وقد اقترح عدد من التقارير أن الدهنية المستمدة من الخلايا الجذعية (الخزفية)، نوع من خلايا mesenchymal stromal (MSC)، يحمل إمكانات العلاج بسبب هذه الوفرة النسبية في الأنسجة الدهنية، وإمكانية الوصول لمجموعة بالمقارنة مع MSCs من الأنسجة الأخرى. ولذلك، يبدو الخزفية مصدرا جيدا لخلايا الجذع للاستخدام العلاجي. في هذه الدراسة، إنشاء أوراق الرابطة من الدهون الدهنية البربخيه العادي لويس الفئران بنجاح باستخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة والمتوسطة الثقافة العادية التي تحتوي على حمض الأسكوربيك. أوراق الرابطة تم زرعها في الجرذان الدهنية السكري (زد دي إف) زوكر، نموذج الفئران من مرض السكري من النوع 2 والبدانة، أن المعرض تقلص التئام الجروح. تم إنشاؤه بجرح على سطح الجمجمة الخلفية وأوراق ASC تم زرعها في الجرح وجلد اصطناعي بلير كان يستخدم لتغطية الأوراق. زد دي إف الفئران التي تلقت أوراق الرابطة كان أفضل التئام الجروح من الفئران زد دي إف دون زرع أوراق ASC. وكان هذا النهج محدودة نظراً لأن الرابطة أوراق حساسة للظروف الجافة، التي تتطلب الحفاظ على بيئة الجرح رطبة. ولذلك، استخدم لتغطية الورقة ASC لمنع تجفيف الجلد الاصطناعي. زرع allogenic أوراق ASC في تركيبة مع الجلد الاصطناعي يمكن أن ينطبق أيضا على غيرها قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت مع أمراض الشرايين الطرفية وأمراض الكولاجين، وقد تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. وهكذا، هذا العلاج قد يكون الخطوة الأولى نحو تحسين الخيارات العلاجية لمرضى السكري الجرح الشفاء.
Introduction
سكان مرضى السكري يتزايد في جميع أنحاء العالم، ووصلت إلى 400 مليون بحلول عام 20151؛ ما يقدر 15-25 ٪ من المرضى الذين يعانون من مرض السكري هم في خطر من تطور قرحة السكري السفلي أقصى2. قرحة السكري السفلي أقصى مستعصية على الحل، وقد تتطلب فترة علاجية طويلة مع إعادة التأهيل التدريب بعد الشفاء الكامل. فترة علاج طويلة وكثيراً ما ينتج عن انخفاض كبير في نوعية حياة المريض. وبالتالي، يجب تطوير علاجات جديدة أن تقليل أو منع تفاقم لعلاج الجروح السكري. نحن الأمثل لتقييم التئام الجرح السكري، قرحة السكري التئام نموذجا في الفئران، الذي يحاكي الظروف السريرية العملية، وتقييم ما إذا كان زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC) الأوراق باستخدام هندسة الخلايا-ورقة تسارع التئام الجروح.
يحمل الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) بإمكانيات ممتازة لتسريع التئام الجروح بسبب قدرتها على التجديد الذاتي، وآثارها إيمونومودولاتوري، وقدرتهم على التفريق في خلية مختلفة الأنساب3. الخزفية نوع من لجنة السلامة البحرية المستمدة من الأنسجة الدهنية، وأنهم يحمل العديد من المزايا المستمدة من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك تلك الأوعية المحتملة و paracrine النشاط4،5MSCs. الأنسجة الدهنية وفيرة نسبيا في الجسم البشري، وإمكانية الوصول إليها ويتيح تجميع باستخدام إجراءات كسبها. ولذلك، استخدمت الخزفية تجريبيا لالتئام تطبيقات6،7.
وقد أظهرت التقارير السابقة أن الحقن المباشر لخلية واحدة ماجستير المعلقات في المناطق المحيطة بالجروح ويمكن التعجيل بالجرح الشفاء8،9. ومع ذلك، وعلى الرغم من التقارير للإسراع بالتئام الجروح في نماذج قرحة السكري بعد حقن تعليق خلية واحدة، الوقت البقاء على قيد الحياة من زرع الخلايا في موقع الجرح ليس واضحا.
في هذه الدراسة، قمنا بتطبيق الهندسة خلية ورقة استخدام أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. هذه الأطباق قد تستجيب لدرجة الحرارة البوليمر N-إيسوبروبيلاكريلاميدي تساهمي ملزمة على السطح عن10. طبقة البوليمر المطعمة يسمح لالتصاق الخلايا درجة الحرارة التي تسيطر على أو مفرزة من السطح الطبق الثقافة. يصبح سطح الطبق مسعور في 37 درجة مئوية، والسماح للخلايا بالانضمام وتتكاثر، حين فصل الخلايا تلقائياً من السطح عندما يصبح ماء في درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. يمكن حصادها الخلايا المستزرعة كورقة خلايا متجاورة مع تقاطعات خلية إلى خلية سليمة ومصفوفات خارج الخلية (ECMs) ببساطة عن طريق تخفيض درجة الحرارة؛ وهكذا، لا proteolytic الإنزيمات التي تلحق الضرر إدارة المحتوى في المؤسسة، مثل التربسين، مطلوب11. ولذلك، يمكن الحفاظ على اتصالات خلية إلى الهندسة خلية ورقة وتحسين فعالية زرع الخلايا.
وباﻹضافة إلى ذلك، زرع خلية ورقة يزيد معدلات بقاء الخلية عند مقارنتها ب حقن الخلية12. واختيرت زوكر السكري الدهنية في الفئران (زد دي إف) في هذا البروتوكول، كنموذج نوع 2 مرض السكري والسمنة مع تأخر التئام الجروح. الفئران زد دي إف تلقائياً وضع السمنة في 4 أسابيع تقريبا. ثم يطورون مرض السكري من النوع 2 مع السمنة بين 8 و 12 أسبوعا من العمر، وعند هذه النقطة يحمل فرط سكر الدم المرتبطة بالانسولين المقاومة ودسليبيدميا hypertriglyceridemia13. كما لوحظت الجرح تأخر الشفاء، تدفق الدم انخفاض في الأوعية الدموية المحيطية، وحدوث السكري14،،من1516. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الفئران زد دي إف نموذجا مناسباً لدراسة الشفاء من القرحة الجلدية المستعصية، مثل قرح مرضى السكري.
الاختلافات بين البشر والقوارض في التئام الآليات المرتبطة بالاختلافات التشريحية في الجلد. الجرح الشفاء في الفئران العادية يستند إلى انكماش الجرح، حين التئام الجروح في البشر يستند تشكيل epithelialization إعادة وتحبيب الأنسجة. بشكل عام، الجرح التجبير المستخدمة في نماذج القوارض يساعد على التقليل من انكماش الجرح ويسمح بتشكيل التدريجي للأنسجة تحبيب17، على الرغم من أن يتم إغلاق الجروح في الفئران نونديابيتيك تقريبا تماما بتقلص. ولكن الجرح السكري الانكماش في زد دي إف الفئران البصر، ويحدث الجرح الشفاء في المقام الأول من خلال إعادة ابيثيلياليزيشن وتشكيل النسيج تحبيب؛ وهكذا، أن هذه العملية أشبه بالجرح البشرية شفاء14.
السكري الجروح مع العظام المكشوفة بعد debridement غالباً ما تواجهها سريرياً. تبحث الدراسات السابقة الجراح الجلد كامل-سمك قطرها 12 مم على ظهورهم athymic الفئران عارية،من18إلى19 والجراح الجلد كامل-سمك قطرها 10 ملم على ظهورهم من الفئران العادية20. إلى وضع نموذج السريري لجروح السكري الحاد، أكبر العيوب كامل-سمك الجلد (15 × 10 مم2) مع كشف العظام ودون السمحاق تم إنشاؤها، كما هو موضح سابقا21، في الفئران مع داء السكري من النوع 2 والبدانة.
الفئران أوراق ASC (مراجعة الحسابات) من الخزفية العادية لويس الفئران تم إنشاؤها من خلال زرع allogenic صحائف ASC. في الممارسة السريرية، زرع ذاتي غير مجد لأنه غالباً ما يحمل مرضى السكري مع القرحة مضاعفات السكري الحادة، مثل مستويات الجلوكوز في الدم غير المنضبط ومؤشرات كتلة الجسم عالية، وهذه مضاعفات قضية التئام الاضطرابات التي تزيد من صعوبة الحصول على الأنسجة الدهنية من هؤلاء المرضى. وعلاوة على ذلك، الخزفية من الحيوانات مع معرض داء السكري تغيير خصائص وإعاقة وظيفة22. ولذلك، يصف البروتوكول المعروضة هنا زرع allogenic أوراق مراجعة الحسابات من الفئران العادية وتطبيق الجلد الاصطناعي للفئران السكري.
الجلد الاصطناعي بيلايير المستخدمة في هذا البروتوكول يمنع انكماش عفوية من الجروح ويعزز التوليف النسيج الضام مصفوفة جديدة ويشبه الأدمة صحيح23. في هذا البروتوكول، ووضعها على ورقة مراجعة الحسابات الجلد الاصطناعي والثابتة مع خيوط النايلون لمنع تقلص الجرح أو توسيع الناتجة عن الفئران فضفاضة الجلد. وبالإضافة إلى ذلك، الجلد الاصطناعي يوفر إطارا ثلاثي الأبعاد للأوراق ASC ويحافظ على بيئة رطبة لزرع أوراق ASC والجروح، والجروح ويحمي من العدوى والقوى الخارجية. وأخيراً، يوضع خلع ملابس غير لاصقة فوق الجرح حمايته من التأثيرات الخارجية، والحفاظ على بيئة رطبة جرح، وامتصاص الإفرازات.
ورقة مراجعة الحسابات رقيقة ومرنة، وتشوه ويمكن التقيد بنقل المواقع المستفيدة، مثل ضرب قلب24. هندسة خلية ورقة قد استخدمت لإعادة بناء الأنسجة المختلفة، ويمكن أن تولد الآثار العلاجية25،26. أوراق الرابطة التي يحمل إمكانات العلاجية السريرية قد تسريع الشفاء من العديد من أنواع الجروح. وعلاوة على ذلك، زرع متمكنة من أوراق ASC، جنبا إلى جنب مع استخدام الجلد الاصطناعي، يمكن تطبيقها لمعالجة قرح مستعصية على الحل أو حروق، مثل تلك التي لوحظت في أمراض الشرايين المحيطية أو أمراض الكولاجين، أو أنها يمكن أن تدار للمرضى الذين يعانون من سوء التغذية أو يتم استخدام المنشطات. هذا النهج يزيد من الكفاءة من زرع الخزفية. نموذج الفئران زد دي إف التئام ينتج شرط جرح شديدة التي تمثل عملية التئام الجرح البشرية ويحاكي الظروف السريرية في الحيوانات تجريبية الصغيرة الحجم.
Protocol
Representative Results
Discussion
أن الخطوات الأكثر أهمية لنجاح استزراع ورقة مراجعة الحسابات كما يلي: 1) يجب الحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 37 درجة مئوية خلال استزراع على أطباق الثقافة المراعية لدرجة الحرارة. أثناء إنشاء ورقة مراجعة الحسابات، تم تنفيذ كل إجراء من الإجراءات على صفيحة حرارية 37 درجة مئوية، وقد ارتفعت درجة ح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور يوكيكو كوجا الإدارة من البلاستيك وجراحة، “كلية الطب جامعة جونتيندو”، لتقديم المشورة العملية. ونشكر أيضا السيد هيدكازو موراتا من “مركز السكري من النساء طوكيو الطبية كلية الطب بجامعة” للدعم الفني الممتاز. وأيد “إنشاء مراكز الابتكار” هذه الدراسة “المتقدم البرنامج مجالات البحوث المتعددة التخصصات” المشروع لنظم الابتكار النامية “خلية ورقة الأنسجة الهندسة مركز (كستيك)” من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) في اليابان.
Materials
| α-MEM glutamax | Invitrogen | 32571-036 | Carlsbad, CA |
| Fetal bovine serum (FBS) | Japan Bioserum Co Ltd. | S1650-500 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Collagenase A | Roche Diagnostics | 10 103 578 001 | Mannheim, Germany |
| 60-cm2 Primaria tissue culture dish | BD Biosciences | 353803 | Franklin Lakes, NJ |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) | Life Technologies | 1490-144 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Life Technologies | 25200-056 | |
| L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate | Wako | 013-19641 | |
| 35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) | CellSeed | NUNC-174904 | Tokyo, Japan |
| Microwarm plate (MP-1000) | Kitazato Science Co., Ltd. | 1111 | |
| Rodent mechanical ventilator | Stoelting | #50206 | Wood Dale, IL |
| 4% isoflurane | Pfizer Japan | 114-13340-3 | Tokyo, Japan |
| Artificial skin (Pelnac®) | Smith & Nephew | PN-R40060 | Tokyo, Japan |
| Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) | Smith & Nephew | 66800679 | Known as Allevyn non-adhessing® in the United State |
| 5-0 nylon suture | Alfresa | EP1105NB45-KF2 | |
| 20 CELLSTAR TUBES | greiner bio-one | 227 261 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430791 | |
| 14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL | Hu-Friedy | P14 | Chicago, IL |
References
- Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
- Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Zuk, P. . The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
- Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
- Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
- Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
- Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
- Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
- Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
- Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
- Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
- Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
- McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
- Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
- Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
- Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
- Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
- Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
- Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
- Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
- Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
- Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
- Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133 (2015).
