Vi beskriver en high-throughput, multiplex, og målrettet proteomik cerebrospinalvæske (CSF) assay udviklet med potentiale for klinisk oversættelse. Testen kan kvantificere potentielle markører og risikofaktorer for neurodegeneration, såsom apolipoprotein E-varianter (E2, E3 og E4), og måle deres allel udtryk.
Mange neurodegenerative sygdomme mangler stadig effektive behandlinger. Pålidelige biomarkører til at identificere og klassificere disse sygdomme vil være vigtig i udviklingen af fremtidige nye behandlingsformer. Ofte potentielle nye biomarkører ikke gøre det til klinikken på grund af begrænsninger i deres udvikling og høje omkostninger. Men målrettede proteomics ved hjælp af flere Reaction Monitoring væskekromatografi-tandem / massespektrometri (MRM LC-MS / MS), specielt ved hjælp af tredobbelt kvadrupol massespektrometre, er en metode, der kan bruges til hurtigt at vurdere og validere biomarkører for klinisk oversættelse til diagnostiske laboratorier . Traditionelt har denne platform vid udstrækning blevet anvendt til måling af små molekyler i kliniske laboratorier, men det er muligt, at analysere proteiner, der gør det til et attraktivt alternativ til ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent assay) -baserede metoder. Vi beskriver her, hvordan målrettet proteomics kan anvendes til at måle multipleksede markører for demens, herunder detektion og kvantificering af den kendte risikofaktor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
For at gøre assayet egnet til oversættelse, er det designet til at være hurtig, enkel, meget specifikke og omkostningseffektiv. For at opnå dette, skal hvert skridt i udviklingen af analysen være optimeret til de individuelle proteiner og væv de er analyseret i. Denne metode beskriver en typisk arbejdsgang herunder forskellige tips og tricks til at udvikle en målrettet proteomics MRM LC-MS / MS til oversættelse .
udvikling Metoden er optimeret ved hjælp af brugerdefinerede syntetiserede versioner af tryptiske quantotypic peptider, der kalibrere MS til påvisning og derefter tilsat til CSF for at bestemme korrekt identifikation af det endogene peptid i kromatografiske separation inden analyse i medlemsstaterne. For at opnå absolute kvantificering, isotopmærkede interne standard versioner af peptiderne med korte aminosyresekvensvarianter tags og indeholder en trypsin-spaltningssted, er inkluderet i assayet.
Den voksende betydning af neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom, Lewy body demens og Parkinsons sygdom, er ved at blive en samfundsøkonomisk problem i mange lande 1. Der er et behov i yderligere biomarkører, der kan bruges til at identificere og klassificere patienter i de tidlige stadier af sygdommen, og at overvåge eventuelle nye behandlinger. Det overordnede mål med denne metode er at skabe en generisk pipeline for en strømlinet, økonomisk og hurtigere måde at validere potentielle CSF markører for neurodegeneration. Rationalet er at bruge målrettede proteomics eller peptid MRM LC-MS / MS som en let amendable metode til at vurdere flere potentielle protein biomarkører fra discovery eksperimenter. Disse kan yderligere multiplekset over en hurtig kromatografisk separation (<10 min) og vurderes. Inden for denne multiplex skærm for neurodegenerative biomarkører, har vi inkluderet den kendte demens risikofaktor apolipoprotein isoform E4 (ApoE4) så vi can samtidig bestemme dens status og udtryk, som denne eliminerer behovet for separate genotypebestemmelserne 2. LC MS / MS anvendes rutinemæssigt som den foretrukne metode til nøjagtig kvantificering af små molekyler i forhold til andre metoder, såsom ELISA eller radioimmunoassay (RIA). Dette skift i brugen af MS-teknologi til at analysere proteiner, er hovedsagelig blevet drevet af problemer med immuno-baserede teknologier. Disse omfatter cross-specificitet, batchdivergens, begrænset holdbarhed, og høje omkostninger. Derfor er målrettede proteomics hurtigt bliver en voksende alternativ til antistofbaserede metoder, såsom Western blotting, RIA og ELISA. Men evnen til at multiplekse mange markører i ét assay er den største fordel ved denne teknik igen immuno-baserede metoder 3. Teknikken kan anvendes på mange væv og har været brugt som en validering strategi for mange proteomics undersøgelser, herunder plasma 4 og urin 5,6.
Den technique kan anvendes på alle laboratorier, der har adgang og ekspertise i at bruge tredobbelt kvadrupol massespektrometre. Peptid design er relativt enkelt med den stigende brug af open source-databaser. Den konkurrenceprægede marked for brugerdefinerede peptider syntese gør dem langt mere overkommelig. Heavy peptider, men er dyre og derfor markørerne bør vurderes på en lille kohorte før du flytter til en større skala. Der er voksende potentiale for teknikken, der skal anvendes i kliniske diagnostiske indstillinger, med de fleste store hospitaler med tripel kvadrupol-baserede platforme, som let kan tilpasses til at køre målrettede proteom assays. En sådan anvendelse af metoden, hvilket gør det til den rutinemæssige diagnostiske indstilling, er dens seneste ansøgning til nyfødte blod spot screening for seglcelleanæmi 7.
Som med alle MS baserede analyser, de kritiske trin i metoden er bestemmelse af de relevante og præcise mængder af interne standarder. Hvis der anvendes absolut kvantificering, så de korrekte mængder af spidse peptider i standardkurven er også kritisk.
Vores assay kræver ikke udfældning af CSF eller anvendelsen af enhver type rengøringstiden eller afsaltning trin før MS-analyse – det er en helt one-pot reaktion metode. På grund af det lille volumen af CSF og dens begræ…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
Urea | Sigma | U0631-500g |
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
Thiourea | Sigma | T7875-500G |
Tris base | Sigma | T6066 |
VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
Acquity UPLC system | Waters |