إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة
Summary
نحن تصف الإنتاجية العالية، متعدد، واستهدفت السائل النخاعي البروتين (CSF) فحص وضعت مع إمكانية الترجمة السريرية. اختبار يمكن quantitate علامات محتملة وعوامل الخطر لالتنكس العصبي، مثل المتغيرات ئي E (E2، E3 وE4)، وقياس التعبير عنها أليلية.
Abstract
العديد من الأمراض العصبية لا تزال تفتقر إلى علاجات فعالة. والمؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتحديد وتصنيف هذه الأمراض تكون مهمة في تطوير علاجات جديدة في المستقبل. في كثير من الأحيان المؤشرات الحيوية الجديدة المحتملة لا تجعل في العيادة بسبب القيود في تنميتها وارتفاع التكاليف. ومع ذلك، البروتينات المستهدفة باستخدام رد فعل متعددة مراقبة اللوني السائل، جنبا إلى جنب / قياس الطيف الكتلي (MRM LC-MS / MS)، وتحديدا باستخدام ثلاثية الطيف كتلة رباعي، هو أسلوب واحد التي يمكن استخدامها لتقييم بسرعة والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية للترجمة السريرية في مختبرات التشخيص . تقليديا، وقد استخدم هذا النظام الأساسي على نطاق واسع لقياس الجزيئات الصغيرة في المختبرات السريرية، ولكن هذا هو القدرة على تحليل البروتينات، التي تجعلها بديلا جذابا لELISA (انزيم مرتبط-Immunosorعازمة الفحص) المستندة إلى الأساليب. نحن هنا وصف كيف البروتينات استهدافا يمكن استخدامها لقياس علامات المضاعفة من الخرف، بما في ذلك كشف وتحديد الكميات من عوامل الخطر المعروفة ئي E الإسوي 4 (ApoE4).
من أجل جعل الفحص مناسبة للترجمة، تم تصميمه ليكون سريعا وبسيطة ومحددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة. ولتحقيق ذلك، يجب أن يكون الأمثل في كل خطوة في تطوير فحص للبروتينات والأنسجة الفردية يتم تحليلها في ويصف هذا الأسلوب سير العمل العادي بما في ذلك مختلف النصائح والحيل لتطوير المستهدفة البروتينات MRM LC-MS / MS للترجمة .
هو الأمثل لتطوير طريقة استخدام الإصدارات تصنيعه حسب الطلب من الببتيدات quantotypic زيتية، الذي معايرة MS للكشف وثم ارتفعت إلى CSF لتحديد التحديد الصحيح للالببتيد الذاتية في الفصل الكروماتوغرافي قبل التحليل في مرض التصلب العصبي المتعدد. لتحقيق ابسولوالشركة المصرية للاتصالات الكميات ومستقرة الإصدارات القياسية الداخلي المسمى النظير من الببتيدات مع قصيرة الأمينية علامات الحمض تسلسل ويحتوي موقع انشقاق التربسين، تدرج في مقايسة.
Introduction
التأثير المتنامي من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ليوي الجسم الخرف ومرض باركنسون، وأصبحت قضية اجتماعية واقتصادية في كثير من البلدان (1). وهناك حاجة في المؤشرات الحيوية الإضافية التي يمكن استخدامها لتحديد وتصنيف المرضى في المراحل المبكرة من المرض، ورصد أي علاجات جديدة محتملة. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو إنشاء خط أنابيب عام عن وسيلة مبسطة والاقتصادية وأسرع من التحقق من علامات CSF المحتملة من التنكس العصبي. الأساس المنطقي لاستخدام البروتينات المستهدفة أو الببتيد MRM LC-MS / MS كطريقة سهولة تعديل لتقييم متعددة المؤشرات الحيوية البروتين المحتملة من التجارب الاكتشاف. هذه يمكن زيادة المضاعفة على الانفصال السريع الكروماتوغرافي (<10 دقيقة) وتقييمها. ضمن هذه الشاشة متعددة لالمؤشرات الحيوية العصبية، أدرجنا المعروفة الخرف عامل خطر ئي الإسوي E4 (ApoE4) لذلك نحن كاليفورنيان تحديد وقت واحد وضعه ومستوى التعبير، من قبل أن يلغي الحاجة لاجراء اختبارات التنميط الجيني منفصلة 2. يستخدم LC MS / MS بشكل روتيني كأسلوب من خيار لquantitating بدقة جزيئات صغيرة على وسائل أخرى مثل ELISA أو المقايسة المناعية الشعاعية (RIA). هذا التحول في استخدام التكنولوجيا MS للبروتينات تحليل، وقد تحركها القضايا مع التكنولوجيات القائمة على المناعة. وتشمل هذه عبر خصوصية، دفعة لاختلاف دفعة، ومحدودية مدة الصلاحية، والتكلفة العالية. لذلك، البروتينات المستهدفة سرعان ما أصبحت بديلا المتزايد على وسائل الأجسام المضادة تستند مثل غرب النشاف، ريا وإليسا. ومع ذلك، فإن القدرة على تعدد العديد من علامات إلى فحص واحدة هي الميزة الرئيسية لهذه التقنية خلال أساليب تعتمد على مناعة 3. هذه التقنية هي التي تنطبق على العديد من الأنسجة، واستخدمت بوصفها استراتيجية تحقق للدراسات العديد من البروتينات بما في ذلك البلازما (4) والبول 5،6.
الشركة المصرية للاتصالاتchnique يمكن تطبيقها على أي مختبر لديه وصول والخبرة في استخدام ثلاثية الطيف الشامل رباعي. تصميم الببتيد هو بسيط نسبيا مع تزايد استخدام قواعد البيانات المفتوحة المصدر. سوق تنافسية من التوليف الببتيدات مخصص يجعلهم أكثر بكثير بأسعار معقولة. الببتيدات الثقيلة، ومع ذلك، غالية الثمن، وبالتالي ينبغي تقييم علامات على المجموعة الصغيرة قبل أن ينتقل إلى نطاق أوسع. هناك احتمال متزايد لهذه التقنية لاستخدامها في إعدادات التشخيص السريري، مع معظم المستشفيات الكبيرة ذات ثلاثية المنصات القائمة رباعية والتي يمكن بسهولة أن تتكيف لتشغيل المقايسات البروتين المستهدفة. واحد من هذا القبيل تطبيق طريقة، مما يجعلها في وضع التشخيص الروتيني، هو تطبيقه مؤخرا لحديثي الولادة فحص بقعة الدم لفقر الدم المنجلي فقر الدم 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو الحال مع جميع المقايسات MS مقرها، والخطوات الحاسمة في الأسلوب هي تحديد الكميات المناسبة والدقيقة من المعايير الداخلية. إذا كان يتم استخدام الكميات المطلقة، ثم المبالغ الصحيحة من الببتيدات ارتفعت في المنحنى القياسي حاسمة أيضا.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;directi…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. . Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
