A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado
Summary
Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.
Abstract
Muitas doenças neurodegenerativas ainda faltam tratamentos efetivos. biomarcadores confiáveis para a identificação e classificação destas doenças será importante para o desenvolvimento de futuras terapias inovadoras. Muitas vezes, os potenciais novos biomarcadores não torná-lo para a clínica devido a limitações no seu desenvolvimento e custos elevados. No entanto, proteômica alvo utilizando a reação múltipla Monitoramento Cromatografia Líquida-tandem / Espectrometria de Massa (MRM LC-MS / MS), especificamente usando triplos espectrômetros de massa quadrupolo, é um método que pode ser utilizado para avaliar rapidamente e validar biomarcadores para a tradução clínica em laboratórios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma tem sido amplamente utilizado para a medição de pequenas moléculas em laboratórios clínicos, mas que é o potencial para analisar proteínas, que faz com que seja uma alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked Immunosordobrado Assay) baseados em métodos. Descrevemos aqui como proteómica direccionada pode ser usada para medir os marcadores multiplexados de demência, incluindo a detecção e quantificação do factor de risco conhecido apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).
A fim de tornar o ensaio adequado para a tradução, que se destina a ser rápido, simples, altamente específica e de custo eficaz. Para conseguir isso, cada etapa no desenvolvimento do ensaio tem de ser optimizado para as proteínas individuais e os tecidos são analisados. Este método descreve um fluxo de trabalho típico incluindo várias dicas e truques para o desenvolvimento de um proteómica alvo MRM LC-MS / MS para a tradução .
O desenvolvimento do método é otimizado usando versões costume sintetizados de peptídeos quantotypic trípticos, que calibrar o MS para detecção e, em seguida, cravado no CSF para determinar a identificação correta do peptídeo endógeno na separação cromatográfica antes da análise no MS. Para atingir absolute de quantificação, padrão interno de versões marcadas com isótopos estáveis de péptidos com marcadores de sequências curtas de aminoácidos e de ácido contendo um local de clivagem de tripsina, são incluídas no ensaio.
Introduction
O impacto cada vez maior de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, demência de Lewy e Doença de Parkinson, está se tornando um problema sócio-económico em muitos países 1. Há uma necessidade em biomarcadores adicionais que podem ser utilizados para identificar e classificar os pacientes nas fases iniciais da doença, e para monitorizar quaisquer potenciais novos tratamentos. O objetivo geral deste método é criar um pipeline genérico para uma forma simplificada, econômico e rápido de validação de marcadores CSF potenciais de neurodegeneração. O objecto consiste em utilizar a proteómica orientadas ou péptido MRM LC-MS / MS como um método facilmente modificável para avaliar múltiplas proteínas biomarcadores potenciais a partir de experiências de descoberta. Estes podem ainda ser multiplexados através de uma separação cromatográfica rápida (<10 minutos) e avaliados. Dentro desta tela multiplex de biomarcadores neurodegenerativas, incluímos a demência conhecido fator de risco apolipoproteína isoforma E4 (ApoE4), de modo que você pn determinar, simultaneamente, o seu estatuto e nível de expressão, pelo que eliminando a necessidade de testes de genotipagem separados 2. LC MS / MS é rotineiramente usado como o método de escolha para a quantificação exacta moléculas pequenas em relação aos outros métodos, tais como ELISA ou radioimunoensaio (RIA). Esta mudança no uso da tecnologia MS para análise de proteínas, tem sido impulsionada principalmente por problemas com as tecnologias baseadas em imuno. Estes incluem cruzada especificidade, variação entre lotes, a vida útil limitada, e o custo elevado. Portanto, proteômica alvo está rapidamente se tornando uma alternativa cada vez maior aos métodos de anticorpos baseados tais como Western blot, RIA e ELISA. No entanto, a capacidade de multiplexar diversos marcadores em um ensaio, é a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos baseados em imuno 3. A técnica é aplicável a muitos tecidos e tem sido utilizada como uma estratégia de validação para estudos diversos proteomics, incluindo o plasma e urina 4 5,6.
o technique pode ser aplicado a qualquer laboratório que tenha acesso e experiência no uso de espectrômetros de massa triplo quadrupolo. projeto peptídeo é relativamente simples, com o crescente uso de bancos de dados de código aberto. O competitivo mercado de síntese de peptídeos personalizados torna muito mais acessível. peptídeos pesados, no entanto, são caros e, portanto, os marcadores devem ser avaliadas em um pequeno grupo antes de se mudar para uma escala maior. Existe um potencial de crescimento para a técnica a ser utilizado nas configurações de diagnóstico clínico, com a maioria dos grandes hospitais tendo plataformas baseadas em triplo quadrupolo, que pode ser facilmente adaptado para executar os ensaios proteomic segmentados. Um exemplo desta aplicação do método, tornando-se na definição de diagnóstico de rotina, é a sua aplicação recente de rastreio mancha de sangue recém-nascido para a anemia falciforme 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tal como acontece com todos os ensaios baseados em MS, os passos críticos no método são a determinação das quantidades apropriadas e exactas dos padrões internos. Se quantificação absoluta está sendo usado, então as quantidades corretas de peptídeos cravado na curva padrão também são fundamentais.
O nosso ensaio não requer a precipitação do CSF ou o uso de qualquer tipo de limpa degraus ou de dessalinização antes da análise por MS – é um método inteiramente reacç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
| Urea | Sigma | U0631-500g |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
| heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
| Thiourea | Sigma | T7875-500G |
| Tris base | Sigma | T6066 |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
| Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
| 300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. . Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer’s disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
