Vi beskriver en hög genomströmning, multiplex, och riktade proteomik cerebrospinalvätska (CSF) analys utvecklad med potential för klinisk översättning. Testet kan kvantifiera potentiella markörer och riskfaktorer för neurodegeneration, såsom apolipoprotein E varianterna (E2, E3 och E4), och mäta deras alleliska uttryck.
Många neurodegenerativa sjukdomar fortfarande saknar effektiva behandlingar. Tillförlitliga biomarkörer för att identifiera och klassificera dessa sjukdomar kommer att vara viktiga i utvecklingen av framtidens nya terapier. Ofta potentiella nya biomarkörer inte gör det i kliniken på grund av begränsningar i deras utveckling och höga kostnader. Men riktade proteomik använder flera Reaction Monitoring vätskekromatografi-tandem / masspektrometri (MRM LC-MS / MS), särskilt med hjälp av trippelkvadrupol masspektrometrar, är en metod som kan användas för att snabbt bedöma och värdera biomarkörer för klinisk översättning till diagnostiklaboratorier . Traditionellt har denna plattform använts i stor omfattning för mätning av små molekyler i kliniska laboratorier, men det finns risk för att analysera proteiner, som gör den till ett attraktivt alternativ till ELISA (Enzyme-Linked Immunosorböjd Assay) -baserade metoder. Vi beskriver här hur riktade proteomik kan användas för att mäta multiplexerade markörer av demens, inklusive detektering och kvantifiering av känd riskfaktor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
För att göra analysen lämplig för översättning, är det avsett att vara en snabb, enkel, mycket specifika och kostnadseffektiv. För att uppnå detta måste varje steg i utvecklingen av analysen optimeras för de enskilda proteiner och vävnader de analyseras i. Denna metod beskriver en typisk arbetsflöde inklusive olika tips och tricks för att utveckla en riktad proteomik MRM LC-MS / MS för översättning .
Metodutveckling optimeras med hjälp av anpassade syntetiserade versioner av tryptiska quantotypic peptider, som kalibrera MS för detektering och sedan spetsade i CSF för att fastställa korrekt identifiering av den endogena peptiden i den kromatografiska separationen före analysen i MS. Att uppnå absolute kvantifiering, stabila isotopmärkta interna standardversioner av de peptider med korta aminosyrasekvenstaggar och innehållande en trypsin-klyvningsstället, ingår i analysen.
Fördjupning av neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom, Lewy body demens och Parkinsons sjukdom, blir en samhällsekonomisk fråga i många länder 1. Det finns ett behov i ytterligare biomarkörer som kan användas för att identifiera och klassificera patienter i ett tidigt skede av sjukdomen, och att övervaka eventuella nya behandlingar. Det övergripande målet med denna metod är att skapa en generisk rörledning för en strömlinjeformad, ekonomisk och snabbare sätt att validera potentiella CSF markörer för neurodegeneration. Skälet är att använda riktade proteomik eller peptid MRM LC-MS / MS som en lätt kan ändras metod för att bedöma flera potentiella protein biomarkörer från upptäckt experiment. Dessa kan vidare multiplexeras över en snabb kromatografisk separation (<10 min) och bedömas. Inom denna multiplex skärm för neurodegenerativa biomarkörer har vi inkluderat den kända demensriskfaktorn apolipoprotein isoform E4 (ApoE4) så vi can bestämma samtidigt sin status och uttryck av att eliminera behovet av separata gentypningstester 2. LC MS / MS används rutinmässigt som den viktigaste metoden för exakt kvantifiering av små molekyler jämfört med andra metoder, såsom ELISA eller radioimmunanalys (RIA). Denna förskjutning i användningen av MS-teknik för att analysera proteiner, har drivits främst av problem med de immuno-baserade teknologier. Dessa innefattar tvär specificitet, variation mellan tillverkningspartier, begränsad hållbarhet och höga kostnader. Därför riktade proteomik snabbt på att bli en växande alternativ till antikroppsbaserade metoder såsom Western blotting, RIA och ELISA. Emellertid är förmågan att multiplexa flera markörer i en analys den största fördelen med denna teknik under immuno-baserade metoder 3. Tekniken kan tillämpas på många vävnader och har använts som en valideringsstrategi för många proteomikstudier inklusive plasma 4 och urin 5,6.
den technique kan tillämpas på alla laboratorier som har tillgång och expertis i att använda trippelkvadrupolmasspektrometer masspektrometrar. Peptid design är relativt enkelt med den ökande användningen av öppen källkod databaser. Den konkurrensutsatta marknaden anpassade peptider syntes gör dem mycket mer prisvärd. Tunga peptider är emellertid dyr och därför markörerna bör bedömas på en liten kohort innan han flyttade till en större skala. Det finns en växande potential för tekniken som ska användas i de kliniska diagnostiska inställningar, med de flesta stora sjukhus har trippelkvadrupol baserade plattformar som lätt kan anpassas för att köra riktade proteomik analyser. En sådan tillämpning av metoden, vilket gör det in i rutinmässig diagnostisk miljö, är dess tillämpning på senare tid till nyfödda blod plats screening för sicklecellanemi 7.
Som med alla MS baserade analyser, de kritiska stegen i förfarandet är att fastställa de lämpliga och exakta mängder av inre standarder. Om absolut kvantifiering används, då de rätta mängderna av spetsade peptider i standardkurvan är också kritisk.
Vår analys kräver inte utfällningen av CSF eller användning av någon typ av rena upp eller avsaltningssteg före MS-analys – det är en helt enkärlsreaktion metod. På grund av den lilla volymen av CSF och dess begränsade komplex…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded and facilitated through the GOSomics research initiative by the National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre at Great Ormond Street Hospital and the UCL Biological Mass Spectrometry Centre at the UCL Institute of Child Health with kind donations from the Szeban Peto Foundation. The Dementia Research Centre is an Alzheimer’s Research UK coordinating centre. The authors acknowledge the support of Alzheimer’s Research UK, the NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre, and Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 |
Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G |
Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 |
Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 |
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 |
Urea | Sigma | U0631-500g |
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 |
Custom synthesised peptides desalted 1-4mg | Genscript | custom |
heavy labelled amino acid [C13 N15] custom peptides | Genscript | custom |
ASB 14 | Merck Millipore | 182750-25gm |
Thiourea | Sigma | T7875-500G |
Tris base | Sigma | T6066 |
VanGuard precolumn | Waters | 186007125 |
Cortecs UPLC C18+ 1.6um 2.1 x50mm column | Waters | 186007114 |
Yeast Enolase | Sigma | E6126 |
300ul clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV |
Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X |
Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system |
Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 |
Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | |
Acquity UPLC system | Waters |