Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos
Summary
Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.
Abstract
miocitos nodo sinusal (SAMs) actúan como los marcapasos naturales del corazón, iniciando cada latido del corazón mediante la generación de potenciales de acción espontáneos (APs). Estos puntos de acceso de marcapasos reflejan la actividad coordinada de numerosas corrientes de membrana y el ciclo de calcio intracelular. Sin embargo, los mecanismos precisos que impulsan la actividad de marcapasos espontánea en SAMs siendo difícil de alcanzar. Aguda SAMs aisladas son una preparación esencial para experimentos para diseccionar la base molecular de marcapasos cardíaco. Sin embargo, la anatomía indistinto, microdisección compleja, y las condiciones de digestión enzimática meticulosos han impedido el uso generalizado de forma aguda aislada SAM. Además, los métodos no estaban disponibles hasta hace poco para permitir el cultivo a largo plazo de las SAM para estudios de expresión de proteínas. Aquí nos proporcionan una demostración de protocolo y de vídeo paso a paso para el aislamiento de las SAM de ratones adultos. Un método también se demuestra para el mantenimiento de ratón adulto SAMs in vitro y para expressien de proteínas exógenas a través de la infección adenoviral. Aguda aislados y SAMs cultivadas preparadas mediante estos métodos son adecuados para una variedad de estudios electrofisiológicos y de formación de imágenes.
Introduction
miocitos marcapasos en el nodo sinusal del corazón (miocitos sinoauricular, "SAM") generan, los potenciales de acción espontáneos rítmicos (APs) que se propagan a través del miocardio para iniciar cada latido del corazón. Los experimentos utilizando SAMs aisladas de forma aguda a partir de muchas especies han sido esenciales para el esclarecimiento de los mecanismos que contribuyen a la generación de actividad marcapasos. SAM son cardiomiocitos altamente especializadas que difieren sustancialmente de sus contrapartes en el miocardio auricular y ventricular en términos de morfología, función y expresión de la proteína. El sello distintivo de los puntos de acceso espontáneas en SAMs es una despolarización espontánea durante la diástole que impulsa el potencial de membrana de umbral para activar la siguiente AP 1,2. Este "potencial marcapasos" depende de la actividad coordinada de muchos diferentes corrientes de membrana incluyendo la "divertida actual" (I f), T y de tipo L corrientes de calcio, y el curr intercambiador de sodio-calcioent (I NCX), que es impulsada por la liberación de Ca2 + desde el retículo sarcoplásmico 3,4.
Si bien de forma aguda aislado ratón SAMs son una preparación experimental esencial para el estudio de marcapasos, el aislamiento de SAMs de ratones puede ser un método difícil de adoptar porque la anatomía indistinta y el pequeño tamaño del ratón SAN requiere una microdisección matizada y la enzimática combinada y mecánico la disociación de las células requiere una cuidadosa optimización.
Proporcionamos aquí una demostración de vídeo detallada de un protocolo que ha sido utilizado con éxito para aislar SAMs de ratones adultos para las grabaciones de patch clamp 5-8. Hasta donde sabemos, no existe tal demostración visual disponible de cualquier otra fuente. Además, un nuevo método se demuestra en las que los aislados SAMs de ratones adultos se pueden mantener in vitro durante varios días, lo que permite la introducción de proteínas, codificados genéticamenteLas moléculas indicadoras o ARNi a través de la infección por adenovirus 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta los protocolos detallados para el aislamiento y cultivo de miocitos completamente diferenciadas nodo sinusal a partir de ratones adultos. El protocolo de aislamiento produce de forma fiable SAMs espontáneamente activas de ratón adecuados, ya sea para el análisis electrofisiológico inmediata o posterior cultivo. Protocolos similares han sido reportados por muchos otros grupos (por ejemplo, véanse las referencias 11,12,10,13-17). Sin embargo, nuestro protocolo para el mantenimiento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
