שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים
Summary
שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.
Abstract
מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.
Introduction
מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, "סאמס") ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP 1,2. זה "פוטנציאל קוצב לב" תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל "הנוכחי המצחיק" (אני F), T-וזרמי סידן L-סוג, ואת curr מחליף נתרן-סידןאף אוזן גרון (אני NCX), אשר מונע על ידי שחרור 2 + Ca מן הרטיקולום sarcoplasmic 3,4.
בעוד סאמס העכבר מבודדים בחריפות מהווים הכנה ניסיוני חיוני לחקר pacemaking, בידודה של סאמס מעכברים יכולה להיות שיטה מאתגר לאמץ בגלל האנטומיה ברור וגודל קטן של SAN העכבר דורש microdissection ניואנסים ואת האנזימטית בשילוב מכני דיסוציאציה של תאים דורש אופטימיזציה זהיר.
אנו מספקים כאן הפגנת וידאו מפורטת של פרוטוקול נוצל בהצלחה לבודדת סאמס מעכברים בוגרים עבור צמד תיקון הקלטות 5-8. למיטב ידיעתנו, אין הפגנה ויזואלית כגון זמינה מכל מקור אחר. בנוסף, שיטה חדשה מודגמת שבודד סאמס מעכברים בוגרים יכול להישמר במבחנה במשך מספר ימים, ובכך לאפשר הכניסה של חלבונים, מקודד גנטימולקולות כתב או RNAi באמצעות זיהום adenoviral 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
