वयस्क चूहों से अलगाव, संस्कृति, और sinoatrial नोड myocytes के कार्यात्मक विशेषताओं के लिए तरीके
Summary
तरीके पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग अध्ययन के लिए वयस्क चूहों से sinoatrial नोड myocytes (SAMs) के अलगाव के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। अलग कक्षों सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है या इस तरह के आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवाददाताओं के रूप में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है।
Abstract
Sinoatrial नोड myocytes (SAMs) दिल की प्राकृतिक पेसमेकर के रूप में कार्य, हर दिल सहज कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) पैदा करने से हराया की शुरुआत। ये पेसमेकर प्राधिकृत व्यक्ति कई झिल्ली धाराओं और intracellular कैल्शियम साइकिल चालन के समन्वित गतिविधि प्रतिबिंबित करते हैं। हालांकि सटीक तंत्र है कि SAMs में सहज पेसमेकर गतिविधि ड्राइव मायावी रहते हैं। तीव्रता से पृथक SAMs प्रयोगों हृदय pacemaking के आणविक आधार काटना करने के लिए एक आवश्यक तैयारी कर रहे हैं। हालांकि, अस्पष्ट शरीर रचना विज्ञान, जटिल microdissection, और नकचढ़ा enzymatic पाचन की स्थिति तीव्रता से पृथक SAMs के व्यापक उपयोग को रोका है। इसके अलावा, तरीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति की पढ़ाई के लिए SAMs की लंबी अवधि संस्कृति को अनुमति देने के लिए हाल ही में जब तक उपलब्ध नहीं थे। यहाँ हम वयस्क चूहों से SAMs के अलगाव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल और वीडियो प्रदर्शन प्रदान करते हैं। एक विधि को भी इन विट्रो में और expressi के लिए वयस्क माउस SAMs बनाए रखने के लिए प्रदर्शन किया हैadenoviral संक्रमण के माध्यम से exogenous प्रोटीन के पर। तीव्रता से अलग-थलग और इन तरीकों के माध्यम से तैयार सुसंस्कृत SAMs electrophysiological और इमेजिंग अध्ययन की एक किस्म के लिए उपयुक्त हैं।
Introduction
दिल की sinoatrial नोड में पेसमेकर myocytes (sinoatrial myocytes, "SAMs") सहज, लयबद्ध कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस) कि मायोकार्डियम के माध्यम से प्रचार हर दिल की धड़कन आरंभ करने के लिए उत्पन्न करते हैं। कई प्रजातियों से तीव्रता से पृथक SAMs का उपयोग कर प्रयोगों तंत्र है कि पेसमेकर गतिविधि के उत्पादन में योगदान की व्याख्या के लिए आवश्यक किया गया है। SAMs अति विशिष्ट cardiomyocytes कि आकृति विज्ञान, समारोह, और प्रोटीन अभिव्यक्ति के मामले में आलिंद और निलय मायोकार्डियम में अपने समकक्षों से काफी अलग हैं। SAMs में सहज प्राधिकृत व्यक्ति की पहचान पाद लंबा है कि सीमा के झिल्ली क्षमता ड्राइव अगले एपी 1,2 को गति प्रदान करने के दौरान एक सहज विध्रुवण है। यह "पेसमेकर संभावित" "अजीब वर्तमान" (मैं च) सहित कई अलग अलग धाराओं झिल्ली, टी और एल प्रकार कैल्शियम धाराओं, और सोडियम-कैल्शियम एक्सचेंजर curr के समन्वित गतिविधि पर निर्भर करता हैईएनटी (मैं NCX), जो sarcoplasmic जालिका 3,4 से सीए 2 रिलीज से प्रेरित है।
जबकि तीव्रता से पृथक माउस SAMs pacemaking के अध्ययन के लिए एक अनिवार्य प्रयोगात्मक तैयारी कर रहे हैं, चूहों से SAMs के अलगाव के एक चुनौतीपूर्ण विधि को अपनाने के लिए हो सकता है क्योंकि अस्पष्ट शरीर रचना विज्ञान और माउस सैन के छोटे आकार के एक सूक्ष्म microdissection और संयुक्त एंजाइमी और यांत्रिक की आवश्यकता है कोशिकाओं की हदबंदी सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है।
हम यहाँ एक प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक पैच दबाना रिकॉर्डिंग 5-8 के लिए वयस्क चूहों से SAMs को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है की एक विस्तृत वीडियो प्रदर्शन प्रदान करते हैं। हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ किसी भी अन्य स्रोत से ऐसी कोई दृश्य प्रदर्शन उपलब्ध है। इसके अलावा, एक नई विधि में जो प्रदर्शन किया है पृथक SAMs वयस्क चूहों से जिससे प्रोटीन की शुरूआत की अनुमति, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग, कई दिनों के लिए इन विट्रो में रखा जा सकता हैसंवाददाता अणुओं या आरएनएआई adenoviral संक्रमण 9 के माध्यम से।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र अलगाव और वयस्क चूहों से पूरी तरह से अलग-अलग sinoatrial नोड myocytes की संस्कृति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। अलगाव प्रोटोकॉल मज़बूती से अनायास सक्रिय माउस या तो तत्काल electrophysiological विश्लेषण या बा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
References
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