방법은 패치 클램프 전기 생리학 또는 이미징 연구를위한 성인 마우스의 동방 노드 근육 세포 (SAM을)의 분리를 위해 증명된다. 분리 된 세포를 직접 사용할 수 또는 부호화 유전자 리포터로서 관심 단백질의 발현을 허용하는 배양에서 유지 될 수있다.
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방법 논문
성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법
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이 논문에서
요약
초록
자발적인 활동 전위 (APS)를 생성하여 이길 각각의 마음을 개시 마음의 자연 페이스 메이커로 동방 노드 근육 세포 (SAM을) 행위. 이 페이스 메이커 AP는 다수의 막 전류와 세포 내 칼슘 자전거의 조정 활동을 반영합니다. 그러나 SAM을에서 자연 페이스 메이커 활동을 구동하는 정확한 메커니즘은 애매 남아있다. 급성 고립 된 SAM은 실험 심장 심장 박동의 분자 기초를 해부하기위한 필수적인 준비합니다. 그러나, 불명료 한 해부학, 복잡한 미세 절제, 그리고 몹시 신경을 쓰는 효소 소화 조건은 급성 고립 된 SAM의 광범위한 사용을 방지했다. 또한, 방법은 단백질 발현 연구에 SAM에의 장기 문화를 허용하는 최근까지 사용할 수 없었다. 여기에서 우리는 성인 쥐에서 SAM을의 분리를위한 단계별 프로토콜 및 비디오 데모를 제공합니다. 방법은 또한 시험 관내 및 expressi 위해 성체 마우스의 SAMs 유지를위한 입증되고아데노 바이러스 감염을 통해 외래 단백질에. 급성 격리 및이 방법에 의해 제조 배양 된 SAM은 전기 생리 및 이미징 연구의 다양한 적합하다.
서론
페이스 메이커의 심장의 동방 노드에서 근육 세포 (동방 근육 세포는, "SAM을")는 각각의 심장 박동을 시작 심근 통해 전파 자연, 리듬 활동 전위 (APS)를 생성합니다. 많은 종에서 급격하게 격리 된 SAM을 사용하여 실험 맥박 조정기 활동의 발생에 기여하는 메커니즘을 해명 필수적이었다. SAM을는 형태, 기능 및 단백질 발현의 관점에서, 심방 및 심실의 심근의 해당 실질적으로 상이 고도로 전문화 심근이다. SAM을 자발적 액세스 포인트들의 특징은 다음 AP 1,2 트리거 임계 막 전위를 구동 이완기 자발적인 탈분극이다. 이러한 "심박 전위"많은 상이한 "재미 전류"(I의 F)을 포함하여 막 전류 T- 및 L 형 칼슘 전류와 나트륨 - 칼슘 교환기 CURR의 활성에 따라 조정근질 세망 3,4에서 칼슘 방출에 의해 구동되는 엔트 (I NCX).
급성 고립 된 마우스 SAM을가 심장 박동의 연구에 필수적인 실험 준비를하는 동안 마우스 SAN의 불명료 한 해부학과 작은 크기가 미묘한 미세 절제와 결합 된 효소 및 기계를 필요로하기 때문에, 마우스에서 SAM을의 분리 채택하기 어려운 방법이 될 수 있습니다 세포의 분리주의 최적화가 필요합니다. ....
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프로토콜
모든 동물의 절차는 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 표준 프로토콜은 다음과 나이 2 ~ 3 개월 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 최적화되었습니다.
1. 실험의 사전에 솔루션 주식 및 용품 준비
참고 : 필요한 장비 및 소모품에 대한 자료 표를 참조하십시오.
- 전체 타이로드의, 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의, 수정 크래프트 - Brühe (KB) 솔루션 및 소 혈청 알부민 (BSA) 해결 방법 : 표 1에 나타낸 바와 같이 1 L 다음 솔루션의 각을 준비합니다. 사용 초순수 모든 솔루션을 탈 이온수를 여과 하였다. 최대 6 개월 동안 20 ° C에서 각각 50 ㎖ 씩에 솔루션 및 저장소를 나눈다. 바로 실험을하기 전에 각각의 분취 량을 해동, 1 주일에 최대 4에 대한 저장6; C.
- 초순수 여과 탈 이온수 (표 1)에 염화나트륨과 염화칼슘이 용해 된 10 mM의 NaCl과 1.8 mM의 CaCl2....
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결과
여기에 설명 된 프로토콜은 이전에 다른 패치 클램프 실험 5-8 다양한 적합한 성인 마우스로부터 자발적 활성 SAM을 분리하기 위해 사용되어왔다. 또한, 프로토콜 최대 1 주 동안 배양 유지할 수있다 절연 SAM을 허용한다. 배양 된 세포로의 유전자 전달은 아데노 바이러스 감염 9를 통해 달성 될 수있다. 이 절에서 제시된 결과는 이전 연구에서 파생과 급성 분리 및 배양 SAM을의 특성의 예로서 여기에 표시됩니다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 자발적 활성 SAM을 최대 6 일 동안 배양 유지할 수있다. 배양 된 세포를 유의 평균 길이, 폭의 변경, 단면적, 또는 배양의 막 커패시턴스, 급성 격리 된 SAM과 매우 유사한 전체 형태를 유지세포는 심하게 격리 세포 (- E
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토론
이 논문은 성인 쥐에서 완전히 차별화 된 동방 노드 근육 세포의 분리 및 문화에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 분리 프로토콜은 안정적으로 즉시 전기 생리 분석 또는 후속 문화 중 하나에 적합한 자연 활성 마우스 SAM에 생성됩니다. 유사한 프로토콜 (예를 들어, 참조 11,12,10,13-17 참조) 많은 다른 그룹에 의해보고되었다. 그러나, 체외에서 성인 마우스 SAM을 유지를위한 우리의 프로토콜은 특징적인 형태, 자발적인 활동 및 세포의 전기 생리 특성을 보존하고 단백질 9의 아데노 바이러스 전달을 위해 수 있습니다.
수정 및 프로토콜의 문제를 들어, 몇 가지 중요한 단계는 주목해야한다. 첫 번째 중요한 요소는 주어진 위해 준비 할 격리 극적 번호의 SAMs의 질을 바꿀 수있는 분해 효소 (1.4 단계)의 활성에 중요한 로트 가변성 인ATION. 이러한 변동은 전형적으로 세포 수 및 건강을 최대화하기 위해 많은 .......
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감사의 글
원고를 비판적으로 읽어주신 Christian Rickert 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, R01-HL088427)의 CP에 대한 보조금의 지원을 받았습니다. EJS는 국립노화연구소(National Institute on Aging)의 5T32-AG000279의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 붕규산 9" 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| 작고 둥근 바닥 배양 튜브 | Fisher Scientific | 352059 | |
| 크고 둥근 바닥 배양 튜브 | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington 생화학 | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | 조직 해리 솔루션 |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| 마우스 라미닌 | 코닝 | CB-354232 | |
| 12mm 라운드 글라스 커버슬립 | Fisher | 12-545-80 | |
| 24웰 배양 플레이트 | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| 플라스틱, 일회용 전사 피펫 | Fisher Scientific | ||
| 마이크로 가위 | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 겸자 | Roboz 계기 | RS-4904 | |
| 조직 집게 | Roboz 계기 | RS-8164 | |
| 해부 홍채 가위 | WPI, Inc. | ||
| 해부 핀 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| 포도당 | 시그마 | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| 타우린 | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-글루타메이트 | Sigma | G1501 | |
| K-아스파르테이트 | Sigma | A6558 | |
| MgSO< sub>4 | Sigma | M7506 | |
| 크레아틴 | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-부탄디온 모노심 (BDM) | 시그마 | B0753 | |
| 소태아 혈청 (FBS) | 시그마 | SH30071 | |
| 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 | A5611 | |
| 인슐린 | 시그마 | I3146 | |
| 트랜스페린 | 시그마 | I3146 | |
| 셀레늄 | 시그마 | I3146 | |
| 페니실린 | GE 헬스케어 | SV30010 | |
| 스트렙토마이신 | 하이클론 | SV30010 |
참고문헌
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J.
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