Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos
Summary
Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.
Abstract
miócitos nó sinusal (SAMs) atuam como os pacemakers naturais do coração, iniciando cada coração bater através da geração de potenciais de ação espontâneos (APs). Estes APs marcapasso refletem a atividade coordenada de numerosas correntes de membrana e ciclismo de cálcio intracelular. No entanto, os mecanismos precisos que impulsionam a atividade pacemaker espontânea em SAMs ainda imperceptíveis. Agudamente SAMs isolados são uma preparação essencial para experimentos para dissecar a base molecular da pacemaking cardíaca. No entanto, a anatomia indistinta, microdissection complexa, e as condições de digestão enzimática mimado ter evitado o uso difundido de forma aguda isolada SAMs. Além disso, os métodos não estavam disponíveis até recentemente para permitir a cultura de longo prazo de SAM para estudos de expressão proteica. Aqui nós fornecemos um passo-a-passo do protocolo e demonstração de vídeo para o isolamento de SAM a partir de ratinhos adultos. Um método também é demonstrada pela manutenção do rato adulto SAM in vitro e para Expressino de proteínas exógenas via infecção por adenovírus. Agudamente isolados e cultivados SAM preparados através destes métodos são adequados para uma variedade de estudos electrofisiológicos e de imagem.
Introduction
miócitos marcapasso no nó sinusal do coração (miócitos sinoatrial, "SAMs") geram, potenciais espontâneos rítmicas ação (APs) que se propagam através do miocárdio para iniciar a cada batimento cardíaco. Experiências utilizando SAM agudamente isolados a partir de muitas espécies têm sido essenciais para a elucidação dos mecanismos que contribuem para a geração da actividade de pacemaker. SAMs são cardiomiócitos altamente especializados que diferem substancialmente dos seus homólogos na atrial e ventricular miocárdio em termos de morfologia, função e expressão da proteína. A marca da APs espontâneos em SAMs é uma despolarização espontânea durante a diástole que impulsiona o potencial de membrana até o limiar para acionar o próximo AP 1,2. Este "potencial pacemaker" depende da actividade coordenada de muitas correntes diferentes de membrana, incluindo o "engraçado corrente" (I), F e G-T- tipo correntes de cálcio, e o permutador de sódio-cálcio CurrEnt (I NCX), que é accionado por libertação de Ca2 + a partir do retículo sarcoplasmático 3,4.
Enquanto intensamente isolado rato SAMs são uma preparação experimental essencial para o estudo da pacemaking, o isolamento de SAMs de camundongos pode ser um método desafiador para adotar, porque a anatomia indistinta e pequeno tamanho do SAN do mouse requer um microdissection diferenciada ea enzimática combinados e mecânica dissociação das células requer optimização cuidada.
Apresentamos aqui uma demonstração de vídeo detalhada de um protocolo que foi usado com sucesso para isolar SAM a partir de murganhos adultos por gravações patch clamp 5-8. Para nosso conhecimento, não existe tal demonstração visual disponível a partir de qualquer outra fonte. Além disso, um novo método é demonstrado em que SAM isolado a partir de ratinhos adultos podem ser mantidas in vitro durante vários dias, permitindo assim a introdução de proteínas, codificado geneticamentemoléculas repórter ou ARNi via infecção adenoviral 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta protocolos detalhados para o isolamento e cultura de totalmente diferenciadas miócitos nó sinusal de ratos adultos. O protocolo de isolamento produz de forma confiável SAMs rato espontaneamente activos adequados para qualquer análise eletrofisiológica imediato ou cultura subsequente. Protocolos semelhantes foram relatados por muitos outros grupos (por exemplo, ver referências 11,12,10,13-17). No entanto, o nosso protocolo para a manutenção do rato adulto in vitro SAM pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
References
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