Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей
Summary
Методы продемонстрированы для выделения САУ миоцитов (Sams) от взрослых мышей для патч зажим электрофизиологии или визуализации исследований. Выделенные клетки могут быть использованы непосредственно или могут быть сохранены в культуре, чтобы обеспечить экспрессию белков, представляющих интерес, таких как генетически кодируемых репортеров.
Abstract
САУ миоциты (Sams) действуют как естественные кардиостимуляторы сердца, инициируя каждым ударом сердца путем генерации спонтанных потенциалов действия (APS). Эти кардиостимуляторов точки доступа отражают согласованную деятельность многочисленных мембранных токов и внутриклеточного кальция езды на велосипеде. Однако точные механизмы, которые управляют спонтанное кардиостимулятора активности в SAMs остаются неуловимыми. Остро изолированные SAMs являются существенной подготовки для экспериментов рассекать молекулярной основы сердца pacemaking. Тем не менее, нечеткие анатомия, комплекс микродиссекции и привередливые ферментативные условия пищеварения предотвратили широкое применение остро изолированной ЗУР. Кроме того, методы не были доступны до недавнего времени, чтобы обеспечить долгосрочную культуру SAMs для экспрессии белка исследований. Здесь мы предлагаем протокол и демонстрации видео шаг за шагом для выделения SAMs от взрослых мышей. Способ также демонстрируется для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке и для Expressiна экзогенных белков через аденовирусной инфекции. Остротоксичные выделяли и культивировали МССП, приготовленные с помощью этих методов пригодны для различных электрофизиологических и визуализации исследований.
Introduction
Кардиостимулятор миоциты в САУ сердца (синусовый миоциты, "SAMs") порождают спонтанные, ритмические потенциалы действия (AP), которые распространяются через миокард инициировать каждый сердцебиение. Эксперименты с использованием остро изолированных Sams из многих видов были необходимы для выяснения механизмов, которые способствуют генерации пейсмекерной активности. SAMs являются узкоспециализированными кардиомиоциты, которые существенно отличаются от их аналогов в предсердий и желудочков миокарда с точки зрения морфологии, функции и экспрессии белка. Отличительной чертой спонтанных точек доступа в SAMs является спонтанной деполяризации во время диастолы , что приводит мембранный потенциал к порогу , чтобы вызвать следующую AP 1,2. Этот "кардиостимулятор потенциал" зависит от скоординированной деятельности многих различных мембранных токов в том числе "забавной тока" (I F), t- и L-типа токи кальция и обменник Curr натриево-кальциевоголор (I NCX), который приводится в действие Ca 2+ освобождения из саркоплазматического ретикулума 3,4.
В то время как остро изолированные мыши SAMs являются существенной экспериментальной подготовки для изучения pacemaking, выделение SAMs у мышей может быть сложным способом принять, потому что нечеткие анатомии и небольшой размер мыши SAN требует нюансированный микродиссекции и комбинированный ферментативных и механических диссоциации клеток требует тщательной оптимизации.
Мы предлагаем здесь подробное видео – демонстрацию протокола , который был успешно использован для выделения Sams от взрослых мышей для патч зажим записи 5-8. Насколько нам известно, нет такой визуальной демонстрации доступны из любого другого источника. Кроме того, новый метод демонстрируется , в котором изолированный Sams от взрослых мышей может поддерживаться в пробирке в течение нескольких дней, позволяя тем самым введение белков, генетически кодируемыхрепортерные молекулы или RNAi через аденовирусной инфекции 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем документе представлены подробные протоколы для изоляции и культуры полностью дифференцированных САУ миоцитов от взрослых мышей. Протокол изоляции надежно производит спонтанно активные Sams мыши, подходящие для любого немедленного электрофизиологического анализа или пос?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-gamma. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
