<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

요약

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

초록

혈뇌장벽(BBB)의 파괴는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 질환 및 동물 모델 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 발병에 중요한 단계입니다. 이 과정은 BBB의 주요 구성 요소인 뇌 내피 세포(EC)를 가로질러 활성화된 T 세포의 전이가 특징이다. 그러나 이러한 T 세포와의 상호 작용에 대한 뇌 EC 기능에 미치는 영향은 대체로 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 시간 경과에 따른 T 세포와의 상호 작용 중 일차 마우스 뇌 미세혈관 EC(MBMEC) 기능 및 장벽 무결성을 평가할 수 있는 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 경내피 전기 저항(TEER) 및 세포층 커패시턴스(Ccl)의 변화를 측정하여 EC 단층 무결성 및 투과성을 연구하기 위한 강력한 도구인 임피던스 세포 분광법을 사용합니다. EC와 직접 접촉하면 자극을 받았지만 미숙하지 않은 T 세포는 TEER의 감소와 Ccl의 증가로 시각화된 바와 같이 EC 단층 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 이 분석은 지속적이고 자동화된 방식으로 EC 단층 무결성의 변화를 기록합니다. 이 단백질은 다양한 자극의 강도와 T 세포 활성화 수준을 구별할 수 있을 만큼 민감하며, 항체, 약리학적 시약 및 사이토카인과 같은 광범위한 물질을 사용하여 T 세포-EC 상호 작용의 표적 조절의 결과를 조사할 수 있습니다. 이 기술은 또한 in vitro T 세포 transmigration 분석에서 EC 무결성에 대한 품질 관리로 사용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램은 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위한 다목적 도구입니다.

서론

^{3 -} 혈액 - 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) ¹ 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB ^2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 ^{- (6)과} 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS ^(7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 ^{- 9.}

이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환....

프로토콜

동물 보호를위한 독일 가이드 라인에 따라 모든 실험에서, 쥐 사육하고 뮌스터 대학의 중앙 동물 시설에서 특정 병원균이없는 조건에서 유지했다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행 노르 트라 인베스트 팔렌, 독일 (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217)의 지방 당국에 의해 승인되었다.

1. MBMEC 분리 및 문화

참고 : 이전에 다음과 같이 수정하여 상세 ^(14)에 설명 된대로 MBMECs을 분리 :

1. CO ₂ 흡입 (6-8 주 이전) (20) 성인 C57BL / 6 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는 그들의 죽음을 확인합니다.
2. 70 % 에탄올로 마우스를 씻어 가위를 사용하여 목을 벨; 집게와 가위를 사용하여 두피를 제거합니다. 난원 매그넘부터 두개골의 좌우에 절개를 만든다. 그것의 꼬리 측과 탁에서 두개골을 들어 올려집게로 뇌를 전자.
3. 층류 후드 만 피질 유지 페트리 접시에 뇌를 배치하고, 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거 무균 핀셋을 사용한다.
   참고 : 현미경의 사용이 단계의 필요하지 않습니다.
4. 멸균 웨스턴 블로 팅 종이 위에 피질을 놓고 수막 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 핀셋으로 가볍게 롤하지 않습....

결과

도 1은 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되는 시험 관내 BBB 모델의 일반적인 개요를 제공한다. 실험은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 뇌 피질에서 기본 MBMECs 단리하고, 5 일 동안 문화이다. 이들이 세포 배양 접시에서 컨 플루 언스에 도달하면 MBMECs는 트립신 처리하고 티이 구에 배치 투과성 인서트로 시드된다. 봉사자와 MBMECs의 CCL은 연속적으로 측정하고 3 ~ 5 일의 기간 동안 모니터링됩니다. 한편, T 세포는 고립 자극 (2 단계), 그리고 2 ~ 5 일, 종류와 자극의 강도 배양. 단계 3에서, T 세포에 첨가하고, CCL 안정된 로우 레벨이고 티이이 최대 레벨 일 때 MBMECs 함께 공동 - 배양 하였다. 봉사자가 고원에서 아직 공동 문화에 대해이 시점을 선택하는 것은 성공을 위해 매우 중요하다전체 측정. 그 T 세포는 ECS에 그들의 첨가시 활성화하여.......

토론

기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) ^{(41, 42)을} 사용하도록 권장한다. 특별한주의 가치 다른 중요한 단계는 사전 - 활성화 된 T 세포를 추가하는 정확한 시점을 식별한다. 봉사자 측정 MBMECs의 첫 48 시간 동안 투과 삽입에 증식과 서로 간의 간격을 닫습니다. 안정된 낮은 수준 (약 0.6 μF / cm ^2)에 도달 할 때까지 따라서, CCL은 감소한다. 이 합류 EC 단층의 첫 징후이지만, 아직 단단한 장벽의 상징이 아니다. 후에 만CCL을은 봉사자가 증가하기 시작 않는 안정적인 수준에 도달했습니다. TJ 착체가 완전히 형성되고 EC 배리어가 완전히 밀폐되면.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	포함: 24웰 셀 모듈, 컨트롤러, cellZscope 소프트웨어 v2.2.2가 설치된 PC
초원심분리기	Thermo Scientific	www.thermoscientific.com	SORVALL RC 6+; 로터 F21S-8x50y; MBMEC 분리
유세포 분석기	Beckman Coulter	www.beckmancoulter.com	T 세포 전이 분석을 위한
FlowJoJo7.6.5 소프트웨어	Tree Star	www.flowjo.com	T 세포 형질전환 분석을 위한
Oak Ridge 원심분리기 튜브, PC	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 ml; MBMEC 절연용
Transwell 멤브레인 인서트 - 기공 크기 0.4 &마이크로; m	Corning	3470	TEER 측정을 위한 주요 판독 Transwell
멤브레인 인서트 - 기공 크기 3 &마이크로; M	Corning	3472	는 T 세포 전이 분석 전 품질 관리로 TEER 측정을 수행하며,
24웰 세포 배양 플레이트	Greiner	650 180	flat-bottom; MBMEC 배양
96웰 세포 배양 플레이트	Costar	3526	round-bottom; 면역 세포 배양용
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	T 세포 및 B 세포 분리용; 지지대 MACS LS 컬럼
OctoMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-109	수지상 세포 분리;세포 계수를 위한 MACS MS 컬럼
Neubauer 계수 챔버	Marienfeld	MF-0640010
세포 스트레이너, 70 µ m	면역 세포 분리를 위한	Corning	352350
세포 스트레이너, 40 &마이크로; 면역	세포 분리를 위한	m Corning	352340
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	면역 세포 격리를 위한
MACS LS 분리 컬럼	세포 및 B 세포 분리를 위한	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MS 분리 컬럼	세포 분리를 위한	Miltenyi Biotec	130-042-201
마우스 CD4 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-049-201	CD4+ T 세포 격리
마우스 CD19 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-201	B 세포 분리
마우스 CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-001	수지상 세포 분리
인간 태반의 콜라겐 IV	Sigma	C5533	MBMEC 코팅 용액
Fibronectin 소 플라즈마	Sigma	F1141-5MG	MBMEC 코팅 용액
Collagenase 2 (CSL2)	Worthington	LS004176	MBMEC 격리
Collagenase/Dispase (C/D)	Roche	11097113001	MBMEC 절연
DNase I	Sigma	DN25	MBMEC 절연
Fetal bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	MBMEC 절연
소 혈청 알부민 (BSA)	Amresco	0332-100G	MBMEC 분리용
Percoll	Sigma	P1644-1L	MBMEC 분리용
DMEM (+ GlutaMAX)	MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지용	Gibco	31966-021
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333	MBMEC 분리 및 MBMEC 배양 배지
인산염 완충	MBMEC 및 면역 세포 분리를 위한	Sigma	D8537
MBMEC 배양 배지를 위한	Heparin		Sigma H3393
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	MBMEC 배양 배지를 위한	PeproTech	100-18B
Puromycin	Sigma	P8833	; 처음 3일 동안만
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	MBMEC 수확용
콜라겐분해효소 IA형	시그마	C9891	수지상 세포 분리용
Trypan Blue 용액, 세포 계수용 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
면역 세포 분리를 위한	EDTA	Sigma	E5134
T 세포 배양 배지 X-VIVO용	1% L-글루타민	Gibco	21980-032
15	Lonza	BE04-418Q	빛으로부터 보호합니다; B 세포 배양 매체
&베타;-메르캅토에탄올	Gibco	31350-010	B 세포 배양 매체
L-글루타민 (100x Glutamax)	Gibco	35050-061	B 세포 배양 배지
마우스 MOG35— 55 펩타이드	Biotrend	BP0328	항원 특이적 T 세포 활성화를 위한
정제된 안티 마우스 CD3 Ab	BioLegend	100302	클론 145-2C11; 다클론 T 세포 활성화를 위해
정제된 NA/LE 안티 마우스 CD28 Ab	BD Pharmingen	553294	클론 37.51; 다클론 T 세포 활성화를 위해
재조합 쥐 IFN-γ	T-세포 전이분석 재	PeproTech	315-05
;	T-세포 전이분석	PeproTech	315-01A
; 항체	BD Biosciences	554408	클론 XMG1.2; 권장 최종 농도: 20 &마이크로; g/ml
Granzyme B 억제제 II	Calbiochem	368055	권장 최종 농도: 10 &마이크로; M
PE 안티 마우스 CD4 항체	Biolegend	116005	클론 RM4-4; T 세포 형질전환 분석용

용 지원 T 수지상 유형 식염수(PBS) MBMEC 배양 배지를 위한IMDM + 는 조합 쥐 TNF-&알파를 위한 NA/LE 정제 안티-마우스 IFN-&감마를 위한