Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט פנוטיפי ניתוח כמותי של מקרופאגים תושב מכליות עכברוש ידי cytometry זרימה. התאים המוכתמים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש גם ליישומים אחרים, כוללים מיון תא, ניתוח ביטוי גנים או מחקרים פונקציונליים, ובכך מגדילים את המידע שהתקבל במודל הניסיון.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול מקומי מוסדיים בעלי חיים ועדות השתמש בעקבות ההוראה 2010/63 / האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי הלאומי מנחה 53/2013.
1. הכנת ריאגנטים ופתרונות
- יש להכין את כל ריאגנטים ופתרונות בתנאים סטריליים ולהשתמש מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן חיץ מכתים (2% עוברית שור סרום (FBS) ב- PBS של 1x Dulbecco).
- כן פתרון collagenase ידי הוספת 0.5 מ"ג של collagenase לכל מיליליטר של תמיסת מלח.
- כן פתרון הרדמה של קטמין / xylazine (2: 1 v / v).
כליות 2. זלוף הפקה
- להרדים חולדות בזריקה intraperitoneal של קטמין / xylazine (75 מ"ג / 12 מ"ג / משקל ק"ג). בזהירות קמצוץ קפל קטן של העור, כדי לבדוק כי בעל החיים הוא הרדים מספיק. לאחר מכן, לכסות את העיניים עם משחת וטרינר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. הערה: 4-monה בן חולדות Wistar משמשות assay זה.
- לאחר העכברוש הוא מורדם לחלוטין, והנח אותו על שולחן ניתוחים במצב שכיבה.
- החל 70% אתנול אל הבטן.
- ביצוע חתך מרכזי דרך העור הצפק בטן, מן החיק אל כלוב הצלעות, לחשוף את חללי פלאורלי ו בטן.
- להזריק תמיסת מלח (0.9%) לתוך אבי העורקים בבטן כדי perfuse הכליות באמצעות מערכת טפטוף עד שכל הדם יוסר הכליות. חותכים את אבי העורקים ברמת הבטן כדי לעזור לשחרר את הדם.
- הסר את שתי הכליות מן החולדה על ידי חיתוך מן hilum כליות (עורק הכליה, העורק שופכן). כדי decapsulate הכליה, לחץ על הקצה של הכליה באמצעות אצבעות, בזהירות להפריד הקפסולה 11.
- מניחים את כליה לתוך תמיסת מלח מאוזנת "הנקס.
3. עיכול כליות תרחיף תא
- חותכים חצי כליה במספריים לחתיכות קטנות ולשים אתחתיכות לתוך צינור 1.5 מ"ל.
הערה: כל הריכוזים הבאים מחושבים 1 מדגם (כליות של עכברוש 1/2). - הוסף 1 מ"ל של תמיסת collagenase לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים על ידי היפוך כל 5 דקות כדי לוודא כי פתרון collagenase ניגש הרקמה כולה.
- לאסוף את הפתרון ולהעביר אותו דרך מסננת (40 מיקרומטר) בעזרת הבוכנה, ואת resuspend אותו 10 מ"ל של חיץ מכתים.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 15 דקות.
- Re- להשעות גלולה ב 1 מ"ל ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) lysing הצפת. לאחר 1 דקות 30 שניות בטמפרטורת החדר, להוסיף 10 מ"ל של חיץ מכתים כדי לעצור את התגובה.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
- Re- להשעות הגלולה בנפח נאות מכתים חיץ (1 מיליליטר) ולסנן את השעית התא באמצעות מסננת (30 מיקרומטר).
- ספירת התאים באמצעות הרחקה trypan כחול על hemocytometer ולהוסיף 2 מיליון תאים לצינור 1.5 מ"ל עבור staining.
4. Cell מכתים ניתוח תזרים Cytometry
- תאי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 5 דקות.
- Re- להשעות גלולה ב 100 μl של סרום חולדה (מדולל 1: 100) במשך 10 דקות ב 4 ° C לחסום קולטני Fc.
- לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ מכתים XG צנטריפוגות 100 במשך 5 דקות.
- מערבבים את נוגדנים מכתים פני התא ב 100 μl של חיץ מכתים עבור כל תנאי: CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) פתרון כדי לזהות תאים חיים (3: 1,000).
- Re- להשעות את התא גלולה בתמהיל נוגדן עבור 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צנטריפוגות מכתים ב 100 XG במשך 5 דקות. חזור על שלב זה.
- להוסיף 600 μl של פתרון קיבוע / Permeabilization במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף 2 פעמים עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
- מוסיפים את הנוגדן CD68 FITC (35: 1000) עבור intracelמכתים lular 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף עבור כל תנאי.
- Re- להשעות גלולה בפתרון נוגדנים CD68 ו דגירה 50 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף עם 1 מ"ל חיץ צנטריפוגות Permeabilization / שטפי ב 170 XG במשך 5 דקות.
- Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / Wash, להוסיף נוגדן CD86PE (35: 1000) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף ידי הוספת 1 מ"ל של Permeabilization / לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 100 XG במשך 5 דקות.
- Re- להשעות גלולה ב 100 μl של חיץ Permeabilization / לשטוף ולהעביר אותו תזרים cytometry צינור.
- ניתוח דגימות על ידי cytometry הזרימה. לקבוע מכתים CD45 ב תאי חיים מגודרים האור המפוזר-Side / אור-המפוזר קדימה חלון (SSC / FSC). במקום השני בשלב, לנתח CD86 וביטוי CD163 בתאים CD68 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתחנו ההטרוגניות מקרופאג במודל ניסיוני דלקתיות של פגיעה כלייתית הקשורים נוכחות מוגברת של הסתננות מקרופאגים בכליות. במודל זה, נזק כלייתי הושרה על ידי הממשל של אלדוסטרון (1 מ"ג -1 ק"ג -1 יום) בתוספת מלח (% NaCl 1) במי שתייה במשך 3 שבועות בחולדות Wistar, כפי שדווח בעבר 12.
לוח הזמנים של הניסויים שלנו מוצג באיור 1. ראשית, תאי הכליה בודדו בשיטות מכניות עיכול אנזימטי נוסף עם collagenase (איור 1 א). לאחר מכן, אריתרוציטים היו lysed ו מקרופאגים כליות אותרו באמצעות cytometry הזרימה. התאים הודגרו עם נוגדנים CD45, CD86 ו CD163 לגילוי הממברנה CD68 מכתים תאיים (איור 1B). לבסוף, את הפנוטיפ של מקרופאג populations נותח על פי התוכנית הראו באיור 1C.
תוכן מקרופאג כליה נותח על ידי בחירת תאים עם חיוביות כפולות עבור CD45 ו CD68 (איור 2 א). באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, גידול CD45 + / CD68 + מקרופאגים נצפתה אצל חולדות שטופלו אלדוסטרון בהשוואה לקבוצת הביקורת (0.57 ± 0.16 לעומת 0.25 ± 0.02,% CD45 + / CD68 + מקרופאגים לכל תאי הכליה הכל) ( איור 2, ר'מסגרת השולחן). כדאיות התא של CD45 + / CD68 + מקרופאגים, כפי שנקבע על ידי זרימת cytometry מכתים עם צבע סגול, היה שגרתי יותר מ 95% (מידע לא מוצג) .Thereafter, CD86 (סמן M1) ו CD163 (סמן M2) ביטוי הוערכה בין CD45 + / CD68 + תאים. אלדוסטרון ממשל הגדיל את התוכן של CD45 + / CD68 + / CD86 + M1מקרופאגים (2.87 ± 2.3 לעומת 1.36 ± 0.68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + מקרופאגים לכל CD45 הכולל + / CD68 + תאים) (איור 2). עם זאת, מספר נמוך של CD45 + / CD68 + / CD163 + M2 מקרופאגים נצפו בשתי הקבוצות אלדוסטרון שטופלו ושליטה. כדי לנתח אם ביטוי CD163 הנמוך היה קשור שפיכת פרוטאוליטים במהלך פרוטוקול הניסוי, אנחנו חוזרים על הליך זה, כולל עיכול collagenase, מקרופאגים מבודדים הצפק חולדה, כפי שתואר לעיל 13. כפי שדווח באיור 2B, CD45 + / CD68 + מקרופאגים הצפק נמצאו חיוביות הן CD86 ו CD163, תיקוף השירות של נוגדנים נבחרים המאשר את האפקטיביות של פרוטוקול שלנו לאפיון של מקרופאגים M1 / M2 בכליה חולדה.
כדי לאמת את התוצאות הללו,את התגובה הדלקתית הקשורים נזק כלייתי במודלים ניסיוניים מעל נחקרה על ידי PCR אימונוהיסטוכימיה ו בזמן אמת. כפי שדווח באיור 3, גדל CD68 + מקרופאגים נצפו אלדוסטרון + מטופלים מלח חולדות, לעומת שליטה. לאחר מכן, סמני פנוטיפ מקרופאג נקבעו לאפיין הפצת מקרופאג M1 / M2 כליות. ביטוי mRNA המוגברת של אינוס ו-γ IFN (סמני M1) נצפה לאחר טיפול אלדוסטרון + מלח, ואילו ARG1 או ביטוי mRNA IL-10 (סמנים מקרופאג M2) לא השתנה לאחר מתן אלדוסטרון. יחד, תוצאות אלה מאשרים כי אלדוסטרון + ממשל מלח מתווך את הפנוטיפ מקרופאג M1 הדלקתי in vivo.
איור 1: פרוטוקול כליה בידוד תאים וזיהוי Macrophage ידי cytometry זרימה. (א) וזיהוי מקרופאג ידי cytometry זרימה (B). ערכת נציג של פנוטיפים מקרופאג השונים על פי חלוקה שונה עבור CD45, CD68, CD86 וסמני CD163 (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: M1 ו- M2 Macrophage סמני הכליות מן אלדוסטרון המטופלים חולדות על ידי הזרימה cytometry dot-מגרשי נציג מכתים CD45 בתאי חיים מגודרים האור המפוזר-Side / אור קדימה-המפוזר (SSC / FSC) חלון (A, עזב. ) מן השעיות כליה מלאה אלדוסטרון + חיות שטופלו מלח. התיבה בתוך חלקות הנקודה מזהה תאי חייםלהביע CD45. תאים כלולים באריזה זו נותחו על מנת לקבוע CD86 וביטוי CD163 ב CD68 + תאים (א ', מימין). Dot מגרש מקרופאגים הצפק כביקורת חיובית לצורך זיהוי של CD45, CD68, CD86 ו CD163, החלו אותה האסטרטגיה השתמשה בעבר. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תגובה דלקתית לאחר מינהל אלדוסטרון + מלח. (א) נציג תמונות של מכתים CD68 ו- (ב) ניתוחים כמותיים של רמות ה- mRNA נמדד על ידי RT-PCR עבור סמנים M1 (אינוס ו INFγ) וסמנים M2 (ARG1 ו- IL-10) בשליטה אלדוסטרון + חולדות שטופלו מלח. נתונים הם מפורשיםed כממוצע ± SEM. * P <0.05 שליטה מול. סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המקרופאגים הם תאים הטרוגנית לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות שונות, כולל הפרעות כליות. יש התעניינות גוברת באפיון של תת מקרופאגים מחלת כליות כי כל תת-אוכלוסיית מקרופאג תורמת בצורה שונה להתפתחות פגיעה כלייתית, כפי שדווחה גלומרולונפריטיס, נפרופתיה סוכרתית בסרטן הכליות 14-16. בשלבים המוקדמים של פגיעה כלייתית חריפה, דומיננטיות של מקרופאגים M1 הוא ציין, קידום נמק ודלקת צינורי. עם זאת, בשלבים מאוחרים יותר תוכן גבוה של מקרופאגים M2 הוא ציין לפתור דלקת ולהשתתף שיפוץ רקמות. במחלת כליות כרונית, הן M1 ו- M2 מקרופאגים להתקיים בו זמנית, למרות M1 יכול להיות שולט, ובכך להגדיל ומנציחי ניזק כלייתי דלקתי. לכן, חשוב להגדיל את ידיעותינו על תפקיד pathophysiological של תת מקרופאג במחלת כליות. מחקרי immunohistochemical לא יכולים לקבוע את האחוז תת מקרופאג בצורה איתנה 17. לכן, יש צורך לפתח טכניקות חדשות כדי לקבוע את פנוטיפים מקרופאג השונים כמותית כדי להבין את התפקיד של תאים אלה על תגובה דלקתית כליות.
כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע את מספר הפנוטיפ של תת מקרופאגים כליות ידי cytometry זרימה בחולדות. במחקר שלנו, חולדות היו נתוני מודל דלקתי של ניזק כלייתי על ידי ממשל של אלדוסטרון. במודל זה, צפינו מוגבר + CD45 ו C68 + חדירת מקרופאג כפי שנקבע על ידי זרימת cytometry ואושר על ידי אימונוהיסטוכימיה. יתר על כן, העשרה של מקרופאגים M1 (CD68 + / CD86 +), אבל לא מקרופאג M2, נצפו עכברים שטופלו אלדוסטרון. תוצאות אלה אושרו עוד יותר על ידי קביעת ביטוי mRNA של M1 (אינוס ו-γ IFN) ו- M2 macrophסמני גיל (ARG1 או IL-10). Cytometry זרימת תמותת תא נמוך דיווח ניתוח במהלך פרוטוקול הבידוד. ישנם מספר גורמים שעשויים להשפיע על כדאיות התא סמנים משטח זיהוי, כגון רמת דיסוציאציה רקמות וכן משך וסוג עיכול רקמות (אנזימטי, מכונאי, וכו '). עיכול מוגזם מגבירת תמותת תאים והפעלת מקרופאג ומפחית ביטוי סמן פני שטח, ואילו ההשפעה ההפוכה לנבוע דיסוציאציה כליה הנמוכה. עם זאת, כאשר הפרוטוקול שלנו התנהל מקרופאגים מבודדים הצפק חולדה, נוכחות משופרת של CD86 ו CD163 נצפתה בתאים אלה.
הפרוטוקול שלנו בצורה מיטבית כדי לקבוע ההטרוגניות מקרופאג בכליות של חולדות עם יתר לחץ דם אלדוסטרון בתיווך, ולכן, ניתן להסיק על מודלי מחלת כליות דלקתיים אחרים. עם זאת, הליך זה עשוי להיות מותאם לכל תנאי ניסוי בגלל משנים דלקתשלמות רקמות, ובכך להשפיע על שיעור של עיכול רקמות על ידי collagenase.
חשוב לציין כי עבור קביעת תוכן מקרופאג הכולל, תאים היו קבועים permeabilized לאפשר תיוג תאי עם נוגדן CD68 18. הפרוטוקול עבור קיבעון כלל שימוש פורמלדהיד שעשוי להשפיע מצומדות fluorochromes כדי נוגדנים ראשוניים, במיוחד Phycoerythrin. כדי לפתור בעיה זו, הדגרה עם נוגדן CD86-PE בוצעה לאחר תוספת של פתרון הקיבוע / Permeabilization ו CD68 המכתים נוסף. מצד השני, חשוב לציין פורמלדהיד, שגם היא יכולה להפריע מבחני אחרים שעלולות להתבצע לאחר בידוד מקרופאגים, כגון מבחני ביטוי mRNA. עם זאת, יש ערכות מסחריות זמינות לבודדים mRNA מתאי קבוע פורמלדהיד.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה לאפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה בתוך quantitative באופן באמצעות cytometry הזרימה. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן הוא קל לשימוש, לשחזור, ושימושי להפלות אוכלוסיות מקרופאג שונות כליות חולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Faster | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Hettich | Or equivalent equipment | |
| Flow cytometer (FACSAria) | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum | BioWest | S1820-500 | |
| PBS 10x | LONZA | BE17-515Q | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 12/1/9001 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A10492-01 | |
| Flow cytometry strainers | BD Biosciences | 340626 | |
| Falcon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 352340 | |
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352052 | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube |
| Centrifuge tubes | Corning centristar | 430791 | |
| Water bath | Memmert GmbH + Co. KG | WNE 7 | 37 °C |
| Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer | BD Biosciences | 554714 | |
| Rompum (Xylazine) | Bayer | Or equivalent | |
| Ketalar (Ketamine) | Pfizer | Or equivalent | |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Saline solution | Braun | 622415 | |
| Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 | Biolegend | 202216 | Diluted 1:100 |
| Anti-CD68 (clone: ED1) FITC | Bio-RAD | MCA341F | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD86 (clone: 24F) PE | Biolegend | 200307 | Diluted 35:1,000 |
| anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 | Bio-RAD | MCA342R | Diluted 4:100 |
| Live/dead stain | Molecular Probes | L34955 | Diluted 3:1,000 |
References
- Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
- Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
- Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
- Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
- Gordon, S.
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
- Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
- Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
- Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
- Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
- Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
- Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
- Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
- Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).
