Automated Robotic Dispensing Technique d'orientation de surface et Bioprinting de cellules

Summary

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Abstract

Ce manuscrit décrit l'introduction d'éléments de guidage de la cellule, suivie par l'administration directe de cellules à ces caractéristiques dans un bioink d'hydrogel à l'aide d'un système de distribution robotique automatisé. Le bioink particulier a été choisi car il permet aux cellules de sédiments vers et détectent les caractéristiques. Le système de distribution bioprints cellules viables dans bioinks hydrogel en utilisant une contre-pression assistée tête d'impression. Toutefois, le remplacement de la tête d'impression avec un stylet ou d'un scalpel aiguisé, le système de distribution peut également être utilisé pour créer des repères topographiques par gravure de la surface. Le mouvement du stylet peut être programmé par incréments de 10 um dans les directions X, Y et Z. Les rainures modelées ont été capables d'orienter les cellules souches mésenchymateuses, les inciter à adopter une morphologie allongée en alignement avec la direction des rainures. Le motif pourrait être conçu en utilisant un logiciel de traçage dans les lignes droites, des cercles concentriques, et des ondes sinusoïdales. Dans une procédure ultérieure, fibroblastes et les cellules souches mésenchymateuses ont été mises en suspension dans une gélatine bioink 2%, pour bioprinting dans une contre-pression entraînée par extrusion tête d'impression. Le bioink de support de cellule est ensuite imprimée en utilisant les mêmes coordonnées programmées utilisées pour la gravure. Les cellules bioprinted étaient capables de détecter et réagir aux caractéristiques gravées comme démontré par leur orientation allongée selon la direction des rainures gravées.

Introduction

La structuration délibérée de placement cellulaire permet la formation de cultures qui imitent in vivo organisation cellulaire ^1. En effet, la recherche sur l'interaction entre plusieurs types de cellules peut être assisté par l' organisation de leur placement ^2,3 spatiale. La plupart des systèmes de mise en forme reposent sur des procédures de modification de surface pour favoriser ou empêcher l'adhérence cellulaire par dépôt de cellules passif subséquente. Bioprinting offre un contrôle spatial et temporel sur les distributions de cellules ^1. En plus de ces fonctions, bioprinting a été décrit comme étant un procédé techniquement simple, rapide et rentable pour générer des échafauds géométriquement complexes ^4. Il utilise un logiciel de conception assistée par ordinateur et permet l'introduction de cellules dans le procédé de fabrication ^4.

Systèmes de Bioprinting ont été classés en fonction de leurs principes de fonctionnement comme laser à base, sur la base d' ^extrusion-4 sur la base jet d' encre ou. Extrusion bioprinting a été décrit comme la plus prometteuse car elle permet la fabrication de constructions organisées de tailles cliniquement pertinentes dans un laps de temps réaliste ^4-6. Elle est réalisée soit par une pression mécanique ou à l'arrière d'extrusion assistée d'un hydrogel bioink de support cellulaire. Dans la méthode présentée ici, la contre-pression a été employée. Comme mentionné précédemment, les cellules sont livrées dans un bioink cytocompatible. Un tel bioink devrait soutenir la fourniture de cellules sans produire de contrainte de cisaillement délétère, et être d'une viscosité suffisante pour maintenir l'intégrité de la trace imprimée, sans effondrement ou de propagation (dénommé «purge d'encre") ^7-10.

L'interaction des cellules avec leur surface adhérente est connue pour influencer le comportement cellulaire. La topographie de la surface peut contrôler la forme de la cellule, l' orientation ^11, et même le phénotype. En particulier, la fabrication des rainures et des canaux ont été démontrées pour induireune étirée, la morphologie allongée sur plusieurs types de cellules. L'adoption de cette morphologie a été trouvé pour influencer le phénotype des cellules multipotentes et pluripotentes. Par exemple, lorsqu'elles sont alignées sur les rainures, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) démontrent la différenciation vers cardiomyocytes ^12,13 et les cellules musculaires lisses vasculaires adopter le phénotype contractile sur synthétique ^10,14-17.

La cellule alignement des canaux ou des rainures peut être générée sur une surface polymère par un certain nombre de méthodes, par exemple, profonde gravure ionique réactive, lithographie électronique, l' impression directe au laser, laser femtoseconde, photolithographie et gravure plasma sec ^18. Ces approches sont souvent longues, nécessitent un appareillage complexe et peut limiter dans la forme du motif généré. En outre, ils ne sont pas synchronisées avec les motifs bioprinting et ne permettent pas de cellularisation immédiat. Le mouvement coordonnée contrôlée d'un automatisésystème de distribution peut suivre des schémas complexes pour le dépôt de solutions. Ici, nous montrons comment le mouvement micrométrique contrôlée peut être exploitée pour créer des canaux pour l'orientation des cellules. Un stylet ou d'un scalpel aiguisé est attaché à la tête d'impression à la place de la seringue d'extrusion et l'équipement peuvent alors graver la surface de polymère sous la direction du logiciel de traçage. La méthode offre une polyvalence dans la conception de modèle et est applicable aux matériaux polymères couramment utilisés en bioingénierie tels que le polystyrène, le PTFE et polycaprolactone. Comme une étape ultérieure à la gravure, les cellules peuvent être directement bioprinted aux rainures rayées. La bioink de gélatine utilisée ici a été en mesure à la fois de maintenir la trace et permettre aux cellules déposées pour détecter les caractéristiques gravées. Les cellules souches mésenchymateuses bioprinted aux rainures gravées ont été démontrées pour allonger le long de ces lignes dans distincts.

Protocol

Remarque: Ce protocole décrit l'utilisation d'une contre-pression du système de distribution robotique assistée (Figure 1A) une gravure superficielle (figure 1B) et à base bioprinter extrusion (figure 1C) 10. 1. La modification d'une surface de polystyrène Utilisez 1 feuilles mm de polystyrène depuis des plaques de culture de tissus de polystyrène ont tendance à incliner vers le haut dans le centre, …

Representative Results

Les résultats représentatifs montrent que le système de distribution robotique de contre – pression assistée peut être utilisé comme la base bioprinter par extrusion pour réaliser une gravure à la fois de la surface et l' impression bioink (figure 1 A). Il peut être utilisé pour la génération de rainures gravées dans la couche superficielle de polymère, et à imprimer ensuite une bioink de support de cellule directement aux caractéristiques (fi…

Discussion

L'étape critique de cette procédure est la livraison de bioprinting réelle des cellules souches comme le processus doit permettre la sédimentation des cellules aux caractéristiques, imprimer sans bioink propagation / saignements, livrer des cellules sans cisaillement mort cellulaire du stress et ne pas déclencher la différenciation vers la lignée non désirée.

Si l'alignement cellulaire attendu ne se produit pas, alors la viscosité de bioink doit être évalué pour son apt…

Materials

Equipment
Robotic Dispensing System	Janome	2300N
Plasma Machine	Femto Science	Covance
USB Microscope
Optical Microscope	Olympus	IX71
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Spreadsheet	Excel	Excel
Printing Co-ordinate Software	Janome	JR C-Points
Imaging Software	National Institutes of Health (NIH)	ImageJ
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Stylus (Blade)	OLFA	AK-5
5ml printing syringe	San-ei Tech	SH10LL-B
30G printing needle	San-ei Tech	SH30-0.25-B
1mm polystyrene sheets		Purchased locally
Fetal bovine serum	Invitrogen	10270-098
Phosphate buffered saline	Invitrogen
Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A	Sigma Aldrich	9000-70-8
αMEM	Invitrogen	41061-029
Antibiotc antimycotic	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)	Cyagen Biosciences Incorporation	RASMX-01201