Summary
تقدم هذه المقالة طريقة للكشف وتقدير الأحماض العضوية من المواد النباتية باستخدام برنامج منطقتين الكهربائي الشعري. مثال على إمكانية تطبيق هذه الطريقة، وتحديد الآثار المترتبة على تخمير الثانوي على مستويات حمض عضوي في بذور القهوة، وتقدم.
Abstract
الأحماض الكربوكسيلية هي الأحماض العضوية التي تحتوي على واحد أو أكثر من محطة الكربوكسيل (COOH) مجموعات وظيفية. سلسلة قصيرة من الأحماض الكربوكسيلية (SCCAs، الأحماض الكربوكسيلية التي تحتوي على 3-6 الكربونات)، مثل مالات وسترات، حاسمة لحسن سير العمل في العديد من الأنظمة البيولوجية، حيث أنها تعمل في التنفس الخلوي، ويمكن أن تكون بمثابة مؤشرات الصحة الخلية. في الأطعمة، يمكن أن محتوى حمض عضوي يكون لها تأثير كبير على الذوق، مع زيادة مستويات سوروس مما أدى إلى الذوق "حامض" الحامض أو. وبسبب هذا، طرق تحليل السريع للمستويات حمض عضوي ذات أهمية خاصة بالنسبة لصناعات الأغذية والمشروبات. ولكن للأسف، فإن معظم الطرق المستخدمة لسوروس الكمي تعتمد على بروتوكولات تستغرق وقتا طويلا يتطلب اشتقاق من العينات مع الكواشف الخطرة، تليها الكروماتوغرافي مكلفة و / أو الطيفي الشامل يحلل. تفاصيل هذه الطريقة أسلوب بديل للكشف وتقدير من غزالهالأحماض القرآنية من المواد النباتية والعينات الغذائية باستخدام برنامج منطقتين الكهربائي الشعرية (تشيكيا)، وأحيانا مجرد يشار إلى الكهربائي الشعرية (CE). يوفر تشيكيا وسيلة فعالة من حيث التكلفة لقياس SCCAs مع الحد الأدنى للكشف عن (0.005 ملغ / مل). تفاصيل هذه المقالة استخراج وتقدير من SCCAs من العينات النباتية. بينما يركز طريقة المقدمة على قياس SCCAs من حبوب البن، يمكن تطبيق الطريقة التي قدمت إلى عدة مواد الغذائية ذات الأصل النباتي.
Protocol
التحضير 1. عينة
- تجميع العينات لسلسلة قصيرة حمض الكربوكسيلية (سوروس) الاستخراج. إعداد 1.0 غرام من بذور القهوة في وقت لضمان أن عينة كافية ستبقى بعد المعالجة.
- إذا تم تجميد العينات قبل عملية الطحن، والحفاظ على الأنسجة المجمدة في جميع أنحاء تجهيز لمنع تجميد / الضرر ذوبان والأكسدة العينة. إزالة عينة من الفريزر أو دون الصفر تخزين فقط حسب الحاجة لطحن.
- فلاش تجميد عينات جديدة في النيتروجين السائل مباشرة قبل أخذ عينات طحن. للحد من التعامل مع العينة، وعينات تجميد فلاش عن طريق وضعها في هاون معبأة سلفا مع النيتروجين السائل.
- تحليل العينات السائلة مباشرة بعد جيل، أو تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينه في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى التحليل. قبل التحليل، وإزالة العينات المجمدة من تخزين والسماح لذوبان الجليد. للعينات السائلة انتقل إلى الخطوة (3.5) للمعالجة.
- ارتداء APPROمعدات الحماية الشخصية priate (بما في ذلك النظارات الواقية، والقفازات، ومعطف المختبر) قبل ان يعمل مع النيتروجين السائل.
- عينات الأنسجة الثلاثي طحن الى مسحوق ناعم بشكل موحد (أي من موحدة حجم الجسيمات) في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة السيراميك.
ملاحظة: بلوغ حجم الجسيمات موحدة أمر ضروري لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة سوروس الاستخراج.- قبل البرد هاون ومدقة مع النيتروجين السائل قبل إضافة العينة. إبقاء هاون مليئة كمية صغيرة من النيتروجين السائل كما يتم إضافة عينة.
- استخدام مغرفة، إضافة ما يكفي من النيتروجين السائل لالهاون لغمر تماما العينة.
- إضافة عينات الأرض بسهولة، مثل الأوراق أو البن المحمص، إلى النيتروجين السائل وسحق باستخدام طحن حركة دائرية. تبدأ لطحن عينات عندما انخفض مستوى النيتروجين السائل لدرجة أنها تغطي بالكاد العينات.
- إضافة بجد لطحن العينات، مثل هذاق بذور البن الخام، والنيتروجين السائل والسماح لهم تجميد لمدة 10-30 ثانية (أو حتى النيتروجين السائل يتوقف عن الغليان بقوة) قبل طحن. كسر الأنسجة إلى أجزاء أصغر باستخدام حركة سحق العمودية، والأنسجة ثم كاملة طحن باستخدام طحن حركة دائرية.
- كرر الخطوات 1.3.2-1.3.4 مرتين أكثر، بحيث يتم تأريض عينات ما مجموعه ثلاث مرات. عادة، سوف ثلاث جولات متتالية من طحن لحد من العينات إلى مسحوق مع مثل الاتساق الدقيق.
- وإذا لم يتم التوصل إلى مثل الاتساق الدقيق، كرر الخطوات 1.3.2-1.3.4 حتى يتم تخفيض العينات إلى مسحوق حجم الجسيمات الصغيرة بشكل موحد (كفاءة استخراج تتناسب عكسيا مع حجم الجسيمات).
- نقل مسحوق لقوارير الزجاج أو 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. بدء التجهيز النهائي مباشرة بعد طحن (مستحسن)، أو عينات مخزن في -80 درجة مئوية حتى عينات مستعدون لاستخراج.
- إذا يجب أن يتم تخزين العينات قبلتحليل، وتقسيم العينة إلى 500 ملغ قسامات (أو 500 مكل للعينات السائلة) وتقسيم بين أنابيب متعددة للتخزين. تجنب تعريض العينات لدورات تجميد / الذوبان المتكررة، وهذه قد يغير تركيبة العينة وتؤثر سلبا قياسات العينات في المستقبل.
2. العضوية إعداد ستاندرد حمض
- تجميع معايير حقيقية لSCCAs من الفائدة. وسوف تستخدم هذه لإيجاد حلول معيار الداخلية والخارجية لاستخدامها في تحديد التركيزات سوروس. لتشمل عينات القهوة الستريك، الماليك، حمض الخليك، وحامض اللبنيك مثل الأحماض المصالح وحمض الأديبيك كمعيار داخلي.
- ضمان التأكد من أن المعيار الداخلي المحدد لا بطبيعة الحال وجدت في العينة، وهذا المعيار لا يشترك في أزل مع قمم أخرى في ملف تعريف العينة.
- تشغيل المنحنيات القياسية لكل سوروس من الفائدة، وتحديد مدى استجابة خطية لكل سوروس (انظر القسم 4 لتشغيل معاهدبالهياج). تأكد من تشغيل المنحنيات القياسية لكل سوروس أن تقاس في العينة.
ملاحظة: يمكن تشغيل المنحنيات القياسية في أي العازلة أو الخلفية من العينة أن يعاير. في الحالة الثانية ( "بالإضافة القياسية")، وسيتم تحديد قيم الذروة مساحة كل نقطة في منحنى القياسية من خلال طرح بعيدا خلفية العينة. - قبل تسمية جميع الأنابيب والأواني الزجاجية اللازمة مع اسم سوروس الحمضية، والتركيز، وتاريخ الفحص.
- إعداد حلول الأوراق المالية لكل مستوى بتركيز معلوم (10 ملغ / مل) باستخدام قارورة حجمية لضمان الدقة أثناء إعداد القياسية.
- حل المعايير سوروس الصلبة (حمض الستريك وحمض الماليك) في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ) لتحقيق التركيز المطلوب للمحلول المخزون.
- إنشاء 10 ملغ / مل حل الأسهم بإضافة 100 ملغ من مستوى إلى 10 مل قارورة حجمية. ملء قارورة حجمية إلى خط 10 مل مع الماء عالى النقاء لدissolve الحامض.
- إنشاء تركيز أقل من مستوى الحمضية أو بلطف تسخين قوارير لدفع يصعب حل المعايير سوروس، مثل حمض الأديبيك، إلى حل.
- تمييع المعايير حمض الطور السائل (حمض الخليك وحمض اللاكتيك) في الماء عالى النقاء لتحقيق التركيز المطلوب.
- قبل ملء قارورة حجمية مع 5 مل من الماء عالى النقاء. إضافة حمض الكافي لإعداد حل 10 ملغ / مل (محسوبة باستخدام كثافة حمض المقدمة من قبل البائع) إلى القارورة، ثم إضافة كمية كافية من الماء لجلب الحجم النهائي من الحل إلى 10 مل.
- حل المعايير سوروس الصلبة (حمض الستريك وحمض الماليك) في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ) لتحقيق التركيز المطلوب للمحلول المخزون.
- نقل كل المحلول إلى أنبوب زجاجي 15 مل نظيفة، مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) مبطنة كأب، وختم مع فيلم البارافين البلاستيك. حلول الأسهم يمكن تخزينها في أنابيب مغلقة في 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع.
- تأكد من أن المعايير سوروس لم عجل من حل قبل الاستخدام إذا تم تبريدها حلول الأوراق المالية بعد preparأوجه. محرك يترسب مرة أخرى إلى حل عن طريق التسخين اللطيف.
- إعداد الحل استخراج سوروس. تشمل معيار الداخلية في تركيز كاف للكشف في عينات (0.05 ملغ / مل). يعد حل ما يكفي لاستخراج جميع العينات.
- تجهيز 50 مل من سوروس حل الاستخراج عن طريق تمييع الحل الأسهم القياسية الداخلي إلى 0.05 ملغ / مل في الماء عالى النقاء. إضافة 250 ميكرولتر من محلول المخزون القياسي الداخلي (10 ملغ / مل) إلى 49.75 مل من الماء.
- إذا احتاج استخراج إلى أن تضعف، وضبط تركيز القياسي الداخلي في حل استخراج بحيث التركيز النهائي سوف تقع ضمن حدود الكمي (إعطاء كشفها، ولكن لم تنته مشبعة، ذروتها، انظر 5.2.2 أدناه) لل نظام CE بعد تخفيفه (0.05 ملغ / مل).
- يعد حل استخراج جديدة لكل سلسلة من عمليات الاستخراج (أي لكل سلسلة التجريبية).
- تحضير عينات منحنى القياسية(سلسلة من التخفيفات المناسبة) لSCCAs من الفائدة، وذلك باستخدام الحد الأدنى لا يقل عن 5 نقاط. وتركيزات منحنى القياسية المستخدمة تحتاج إلى أن تكون في مدى استجابة خطية لسوروس معين، وتمتد على تركيزات سوروس المتوقع في العينات.
- تشمل معيار الداخلية مختارة في الحلول منحنى القياسية للسماح الكمي لمعيار الداخلية في العينات. سيتم استخدام معيار داخلي للمساعدة في ذروة تحديد وحساب كفاءة الاستخراج (المادة 6).
- تمييع كل سوروس لتركيزات تحدد فوق (0.01، 0.02، 0.04، 0.06، 0.08 ملغ / مل، وانظر أعلاه، 2.4.2) في أنابيب microcentrifuge جديدة (واحد لكل / نقطة منحنى القياسية تركيز) باستخدام الماء عالى النقاء. إعداد 1 مل من محلول لكل نقطة تركيز منحنى القياسية. تأكد من أن كل نقطة تركيز على كافة مستويات حمض الأربعة ومعيار الداخلية في التركيز الصحيح.
- إعداد نقاط منحنى القياسية جديدة لكل مجموعةمن عينات ليتم تشغيلها على نظام الشعرية الكهربائي. عقد العينات القياسية منحنى سوروس في 4 درجة مئوية حتى التحليل، والتي سوف تحدث بعد استخراج SCCAs من الأنسجة المستهدفة (القسم 3).
3. العضوية حمض استخراج
- قبل تسمية أنابيب العينات، وإعداد أنبوب واحد على الأقل لكل عينة لاستخراج.
- إزالة عينات لالمستخرجة من تخزين ووضعها على الجليد بينما وزنها من المواد اللازمة لاستخراج.
- تزن من 100 ملغ من عينة لاستخراج سوروس.
- بعد وزنها كل عينة، ونقل الأنسجة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل نظيف. قياس من أصل كمية من العينة أقرب إلى كتلة الهدف ممكن للحد من التباين.
- تتبع كتلة كل عينة تقاس، كما سيتم تطبيع مبالغ SCCAs الكشف باستخدام كتلة عينة (انظر 6.5.2 أدناه).
- بعد وزنها جميع العينات، إضافة 1 مل من محلول الاستخلاص (لتوفير المياهص + خليط القياسي الداخلي من الخطوة 2.4) إلى كل من أنابيب العينات. الحفاظ على نسبة من حل استخراج لكتلة الأنسجة نفسها في جميع الاستخراج (في هذه الحالة 1 مل لمدة 100 ± 5 الأنسجة ملغ). مزيج جيد من قبل دوامة لمدة 10 ثانية.
- السماح للعينات للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. خلال هذه الساعة، خلط كل أنبوب كل 15 دقيقة كما في الخطوة 3.4.
- بعد 1 ساعة من الاستخراج، ومزج العينات مرة أخيرة واحد ونقل أنابيب العينات إلى microcentrifuge ل. عينات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لترسيب المواد الصلبة (جدران الخلايا، الجسيمات، وما إلى ذلك).
- عند معالجة عينات السائل، إضافة التركيز المناسب من معيار الداخلية، مزيج لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، وعلاج العينات السائلة مماثل لاستخراج عينات من الصلبة.
- تحقق من الرقم الهيدروجيني للعينات للتأكد من أنها متوافقة مع مجموعة والرقم الهيدروجيني للعازلة تعمل في عدة كشف (الخطوة 4.6) أو المخزن المؤقت النظام كونها خطة الإدارة البيئيةloyed. إذ بلغ حجم العينة وعادة ما تكون صغيرة جدا، ويمكن رصد درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني.
- إعداد لتصفية العينات باستخدام مرشحات القرص محمولة على حقنة (3.8).
ملاحظة: منع فقدان العينة من خلال ضمان أن كل مرشح يرد بشكل صحيح إلى حقنة قبل نقل طاف. تحضير حقنة واحدة مجهزة مرشح القرص لكل عينة لتحليلها (بما في ذلك عينات منحنى قياسي). - بعد الطرد المركزي العينات وإعداد المرشحات المحاقن، ونقل طاف من كل عينة لحقنة 3 مل مجهزة مرشح حقنة 0.2 ميكرون. استخدام فلتر جديد وحقنة لكل عينة. تصفية جميع العينات، بما في ذلك عينات منحنى القياسية والضوابط العازلة، قبل أن يعمل على نظام CE.
- تصفية العينة مباشرة إلى أنبوب microcentrifuge نظيفة. بعد الترشيح، وإغلاق الأنبوب الذي يحتوي الترشيح وتجاهل جهاز حقنة / فلتر.
- وضع العينات التي تمت تصفيتها على الفورفي نظام CE للكشف سوروس. أو عينات تخزين عند 4 درجات مئوية خلال الليل. إذا عينات ليتم تخزينها بين عشية وضحاها، وختم الأنابيب مع فيلم البارافين البلاستيك لمنع تبادل الغازات وعينة التبخر.
- إذا يجب أن يتم تخزين العينات لفترة أطول من يوم واحد بعد تصفية وعصائر فلاش التجميد في النيتروجين السائل أو التجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. بعد ذوبان الجليد، ومع ذلك، تأكد من أن كل عينة يتم فحص لتشكيل متهور وتصفية إذا لزم الأمر (كما في الخطوة 3.6).
4. إعداد كشف سوروس تشغيل
- راجع دليل المستخدم CE للحصول على تفاصيل البرامج الخاصة programming- والسيطرة.
- إعداد الشعرية الكهربائي (CE) قارورة عينة للكشف سوروس. وصفت ضمان قارورة بشكل صحيح ونظيفة وخالية من العيوب.
- غسل وتجفيف قبعات من قارورة CE قبل الاستخدام.
- غسل أغطية من قبل غمر في الماء عالى النقاء والسماح لهم نقع بين عشية وضحاها. بعد تمرغ القبعات، وتجاهل نقعجي الحل وشطف قبعات مرتين أكثر مع الماء عالى النقاء.
- نقل تشطف قبعات على سطح تجفيف نظيفة تصطف مع أنسجة خالية من الوبر والسماح لهم الهواء الجاف. ضمان قبعات جافة تماما قبل استخدامها لتجنب الفشل الضغط.
- نقل 1 مل من العينة إلى كل قارورة CE، والحرص على تجنب قصد الرش العينة إلى عنق القارورة. بعد نقل، وضع سقف CE على كل قارورة.
- إذا كانت هناك حاجة لتخفيف، يخفف من عينات البذور القهوة 1:10 أو 1: 100 مباشرة في قارورة CE باستخدام الماء عالى النقاء. لالتخفيفات أكبر من 1: 100، إنشاء التخفيف الأوسط لتفادي الأخطاء pipetting ل.
- إعداد قارورة واحدة لكل نقطة في منحنى القياسية من خلال نقل الحلول منحنى القياسية (1.0 مل) من الخطوة 2.5 إلى قارورة م. سقف كل أنبوب بعد التحويل.
- إعداد محلول 0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) وذلك بإضافة 0.04 غرام من هيدروكسيد الصوديوم إلى دورق يحتوي على 90 مل من الماء عالى النقاء والسماح للالكريات رس حل. نقل الحل 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 100 قارورة حجمية مل وجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل.
- إضافة 1 مل من 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم إلى قارورة CE نظيفة والغطاء.
- إعداد قارورة عازلة CE لكل دفعة من عينات ليتم تشغيلها على نظام CE. تتوفر مجموعات الانفصال أو مخازن مخصصة يمكن استخدام 13.
- إعداد 1 فيال مع 1 مل من بدء حل العازلة والغطاء.
- إعداد ثلاث قوارير مع 1 مل كل من يعمل حل العازلة والغطاء. استبدال المخزن المؤقت قيد التشغيل قبل كل دفعة من العينات ونقاط منحنى القياسية، أو بعد 35 عينات، أيهما أسبق.
- ملء ثلاثة قنينات إضافية مع 1 مل من الماء عالى النقاء وتتويج كل قارورة.
- إعداد 1 فارغة "النفايات" قنينة مع غطاء.
- بعد إعداد قارورة هو موضح في الخطوة 4.8، تحميل قارورة تحتوي على مخازن والمياه، فضلا عن قارورة النفايات (من الخطوات 4.8.2-5) في علبة عازلة للتميز الكلية الشعرية الكهربائيتيم، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة 15. يجب الانتباه إلى موقف كل قنينة للبرمجة لصناعة السيارات في العينات.
- تحميل قارورة تحتوي على نقاط منحنى القياسية وقارورة تحتوي على عينات ليعاير في علبة عينة مدخل، كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة. لاحظ موقف كل قنينة للبرمجة السيارات العينات (انظر الخطوات 4.11.1 أدناه).
- إعداد تكييف وطرق الفصل العينة (يتم توفير برامج لهذه في الجدولين 1 و 2 على التوالي)، والكتابة ملف تسلسل عينة وفقا للتعليمات التي تعمل الصك. استخدام طريقة فصل تفصيلا في الجدول 2: شطف العمود مع البادئ (20 رطل) 0.2 دقيقة. شطف مع مسرع (20 رطل) 0.5 دقيقة، حقن عينات (0.5 رطل) على عمود 0.09 دقيقة، وعينات منفصلة في 20 كيلو فولت لمدة 12 دقيقة، شطف مع هيدروكسيد الصوديوم (20 رطل) 0.5 دقيقة، وشطف أخيرا مع الماء ( 20 رطل) 0.5 دقيقة.
- باليودنانوغرام برنامج حاسوبي لمراقبة CE، كتابة عينة تشغيل تسلسل (أي worklist، ملف قائمة تتضمن تفاصيل عن الترتيب الذي سيتم تحليل العينات، والطريقة التي ستستخدم للفصل بين كل عينة) باستخدام "تسلسل" واجهة البيانات. وكل صف في جدول البيانات تتوافق مع تشغيل عينة وينتج ملف بيانات واحد.
- تأكد من أن عند كتابة ملف تسلسل، ويتم تحديد العينات باستخدام الموضع الصحيح في علبة أخذ العينات. تأكد من أن كل ملف البيانات له اسم فريد لمنع البرنامج من الكتابة فوق الملفات السابقة. برنامج CE يعمل تكييف الشعرية كتسلسل منفصل قبل تشغيل تسلسل تحتوي على طريقة فصل العينة.
- بدء تسلسل عينة تشغيل مع حلول منحنى القياسية، تليها عينات سوروس، وتنتهي الجولة الثانية من الحلول منحنى القياسية. وهذا سوف يسمح لحساب درجة من أي خسارة إشارة تحدث خلال تحليل عينة. </ رأ>
- باليودنانوغرام برنامج حاسوبي لمراقبة CE، كتابة عينة تشغيل تسلسل (أي worklist، ملف قائمة تتضمن تفاصيل عن الترتيب الذي سيتم تحليل العينات، والطريقة التي ستستخدم للفصل بين كل عينة) باستخدام "تسلسل" واجهة البيانات. وكل صف في جدول البيانات تتوافق مع تشغيل عينة وينتج ملف بيانات واحد.
الجدول 1: برنامج طريقة تكييف المستخدمة في إعداد الشعرية لفصل حمض الكربوكسيلية قصيرة السلسلة عبر الشعرية الكهربائي ل.
الجدول 2: برنامج طريقة الفصل المستخدمة لتحليل سلسلة قصيرة من الأحماض الكربوكسيلية عن طريق الشعيرات الدموية الكهربائي ل.
5. كشف سوروس تشغيل تنفيذ وجمع البيانات
- بدء تشغيل تكييف الشعرية. نتوقع أن شرط الشعرية مرتين أو ثلاث مرات قبل العمود جاهز للفصل العينة. يجب أن يتم تنفيذ تكييف العمود كما هو موضح في الجدول رقم 1 لفترة وجيزة، وشطف العمود مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم (20 رطل) لمدة 1 دقيقة ثم يشطف بالماء (20 رطل) ل1 دقيقة، شطف مع البادئ (20 رطل) 0.5 دقيقة، شطف مع مسرع (20 رطل) 0.5 دقيقة، مسرع منفصل في 30 كيلو فولت لمدة 10 دقيقة، شطف العمود مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم (20 رطل) 0.5 دقيقة، وأخيرا شطف العمود بالماء (20 رطل) 0.5 دقيقة.
- شرط الشعرية قبل كل تسلسل عينة التشغيل. تحقيق تكييف مناسب عن طريق الحفاظ على الجهد الانفصال هو ثابت في جميع أنحاء تشغيل ومراقبة خط الأساس شقة على التتبع الضوئي مجموعة.
- بعد تكييف، والشروع في فصل عينة عن طريق فتح "السيطرة" القائمة في البرنامج واختيار (أي صفحة) على "تشغيل تسلسل." مراقبة التتبع الضوئي مجموعة (PDA) لضمان الفصل السليم.
- مراقبة التتبع الأول وضمان أن لديها خط الأساس شقة وحلها نظيفة (القرار الأساس)، قمم حمض الفردية. والإفراط في تحميل عينات تظهر ذيول ذروة طويلة، أو ذروة المخلفات، وسوف تحتاج إلى أن تضعف (الشكل 1).
الشكل 1: مقارنة بين PDA آثار تسليط الضوء على عينة زائد كما يزيد من تركيز تحليلها، قد تبدأ الفردية ذروة الهندسة لتصبح غير المتماثلة. في (أ) 0.05 ملغ / مل، ويعرض حمض الخليك واضحة المعالم، ذروة متناظرة ثنائيا. وحيث أن تركيز زيادة حمض الخليك إلى (ب) 0.07 ملغ / مل و (ج) 0.10 ملغ / مل، وأشكال ذروة الذيل (السهام). هذه الذروة المخلفات هو مؤشر جيد على أن العينة طاقتها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- وفي ختام المدى تسلسل، وفتح ملفات البيانات في وقت واحد في برامج التحليل م، ودمج القمم.
- دمج قمم العينة.
- فتح الملف الأولوتعيين خطوات التكامل التلقائي لاستبعاد 3 دقيقة الأولى من الشوط (حيث الجهد، وبالتالي فإن اتجاه تدفق العمود، هو مقلوب كما هو موضح في الجدول رقم 1). في نفس القائمة، وضع معايير اختيار الذروة إلى الذروة عرض الحد الأدنى من 50 وحدة ومنطقة الذروة من 100 وحدة (أو الإعدادات الافتراضية للمصنع) لتوفير مستوى عال نسبيا من الانتقائية، التي تفصل القمم حمض من الضوضاء في الخلفية في التتبع.
- التحقق يدويا حدود الذروة وخطوط الأساس لكل أثر المساعد الشخصي الرقمي لضمان ذروة التكامل السليم. قمم متكاملة بشكل غير صحيح (أي ذروة SSCA غير المتكافئة قليلا أن تم دمجها عن اثنين من قمم منفصلة من قبل برامج الحاسوب الآلي) سوف تحتاج إلى إعادة دمج يدويا.
- دمج قمم العينة.
- بعد الاندماج، عرض التقرير منطقة في المئة، ثم تسليط الضوء على ونسخ التقرير منطقة في المئة ولصقه في جدول منفصل. كرر لكل عينة لبناء تشغيل كامل ذروة التقرير!ر مع كل صف يمثل ذروة واحدة (أي، يجب أن تحتوي كل الذروة مركب واحد إذا كان يعمل الفصل أيضا).
تحليل 6. البيانات
- إعداد البيانات للتحليل باستخدام جداول البيانات التي شيدت في (5.4). يبدأ التحليل وصفها المعايير الحامضية لكل من نقاط منحنى القياسية، بما في ذلك معيار الداخلية.
- حساب مؤشر الاحتفاظ لكل الذروة من خلال تقسيم الوقت الاحتفاظ لكل الذروة في العينة في الوقت الإبقاء على مستوى الداخلي في تلك العينة. فرز البيانات تلاه مؤشر الاحتفاظ مما أدى المقرر أن تحديد قمم الفائدة في كل عينة.
- بعد تحديد الذروة لكل حمض الفائدة، وبناء منحنيات القياسية لكل حمض باستخدام نقاط منحنى معيار خارجي.
- توليد منحنى مستوى (تركيز) لكل معيار سوروس عن طريق تحديد منطقة ذروة لكل تركيز من المعايير سوروس، والتآمر التركيز على XAxis مقابل ذروة منطقة تقع على المحور الصادي. رسم الانحدار الخطي لكل المنحنى القياسي سوروس وتحديد معادلة الانحدار (ص = م × + ب).
- تأكد من أن R 2 قيم الانحدار الخطي هي 0.90 أو أعلى كما يتم تنفيذ التحديد الكمي الأكثر دقة في مجموعة خطية من المنحنى القياسي.
- حساب تركيز الحمض لسوروس معين في عينة باستخدام منطقة ذروة ومعادلة انحدار للخط الانحدار الخطي المنحنى القياسي (المحسوبة في 6.3.2 أعلاه). لفترة وجيزة، وتقسيم ذروة المنطقة المرصودة للحمض التي قدمها المنحدر من خط الانحدار لمنحنى القياسية حمض ل.
- تصحيح قيم تركيز الخام المحسوبة في الخطوة 6.4 لفقدان العينة أثناء معالجة باستخدام معيار الداخلي (الخطوة 6.5).
- حساب معامل التصحيح لكل عينة باستخدام معيار الداخلية.
- تقسيم التركيز الفعلي للمعيار الداخلية (أي كنوكمية سفل وأضاف في بداية التجربة) من قيمة تمت ملاحظتها على مستوى الداخلي في العينة (أي المبلغ المحسوب باستخدام معادلة انحدار منحنى القياسية لمعيار داخلي). مضاعفة قيم تركيز الخام من كل سوروس في عينة من هذا معامل التصحيح.
- تقسيم معيار داخلي تصحيح تركيز سوروس من قبل كتلة العينة المستخدمة لاستخراج لتصحيح أي اختلاف في كتلة العينة. هذا الحساب ينتج كمية الحليلة في كتلة العينة (ملغ سوروس في ملغ البن المطحون في هذا المثال)، ومن ثم يمكن تحويلها إلى وحدات مناسبة لدراسة معينة (ملغم / ملغ، ملغ / ز، ز / ز، الخ ).
- بعد حساب تركيزات سوروس (تطبيع إما إلى كتلة [لعينات صلبة أو سائلة] أو حجم [للعينات السائلة])، واستخدام هذه القيم للتحليل الإحصائي وفقا لمتطلبات التصميم التجريبي والمسائل ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لقياس الآثار المترتبة على معاملة البذور على محتوى سوروس من بذور البن الخضراء. في هذه التجربة، كانت العلاجات ستة: تعليق الميكروبية المشبعة من النستقة pseudomesenteroides سلالة GCP674 في متوسطة النمو (1)، وهو تعليق مائي من GCP674 الميكروبات في الماء (2)، وهو محلول مائي من حمض الخليك وأحماض اللاكتيك (0.15 و 0.4 ملغ / مل على التوالي) (3)، وقضى M1 متوسط النمو العلاج (4)، O 2 درهم المياه (5)، ومراقبة من الامم المتحدة والمعالجة (أي مادة تضاف إلى البذور) (6). طبقت العلاجات والسماح للتخمر لمدة 24 ساعة. تم تقييم أربعة مكررات مستقلة لكل معاملة. أجري تحليل لالستريك (C)، الماليك (M)، الخليك (A) ومستويات اللبنيك (L) حمض استخدام حمض الأديبيك كمعيار داخلي.
لكل سوروس ومعيار الداخلية، والمنحنيات القياسية التي تغطي روتوقع مجموعة من تركيزات أن يكون في عينات القهوة (5، 10، 20، 40، 60، و 80 نانوغرام / ميكرولتر) تم إنشاؤها. كما هو متوقع، كل حمض أظهرت استجابة خطية لهذا النطاق التركيز مع القيم التربيعية-R من 0.9876 لحامض الستريك، 0.9987 للحمض الماليك، 0.9998 لحمض الخليك، و0.9999 لحامض اللبنيك. المعيار الداخلي (حمض الأديبيك) كما أظهرت استجابة الخطية على هذا النطاق التركيز، مما أسفر عن قيمة التربيعية-R من 0.9984. قبل أخذ عينات التحاليل، تم تحديد حدود الكشف (اللد) وحدود الكميات (LOQ) لكل سوروس والمعيار الداخلي (حمض الأديبيك). وكان الحد من الكشف عن الستريك، الماليك، حمض الخليك، وحمض الأديبيك 1 نانوغرام / ميكرولتر. وكان اللد لحامض اللبنيك 2 نانوغرام / ميكرولتر. وكان الحد من الكميات من الليمون، الأديبيك، الخليك، وحمض اللبن 4 نانوغرام / ميكرولتر. وكان LOQ للحمض الماليك 2 نانوغرام / ميكرولتر. لحساب SCCAs الانتعاش في المئة وحمض الأديبيك، وقد ارتفعت القهوة مع SCCAs الفردية أو حمض الأديبيك والعمليات:د باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه. ثم تم احتساب الانتعاش في المئة باستخدام الصيغة التالية ([{منطقة ذروة ارتفعت عينة - ذروة تحكم مجال عينة} / قمة منطقة النظرية للتركيز تحسب من عينة ارتفعت {الناتجة عن تحليل عازلة + سوروس / الأديبيك ارتفاع حمض}] × 100) . باستخدام هذه الطريقة، حسبنا المبالغ المستردة في المئة من 106.08٪ ± 12.66 لحامض الستريك، 98.35٪ ± 1.15 لحامض الماليك، 91.94٪ ± 3.07 لحامض الخليك، 97.42٪ ± 1.48 لحامض اللبنيك، و100.19٪ ± 2.57 للحمض الأديبيك.
لتحديد دقة الأسلوب، فإن التباين داخل وبين يوما من القياسات باستخدام حسبت أيضا تشيكيا. لتحديد التغير اليوم الواحد، وقد تم قياس عينات من كل سوروس وحمض الأديبيك من عينة قهوة واحد خمس مرات في فترة 24 ساعة، ومعاملات التباين (COV و تحسب بقسمة الانحراف المعياري في منطقة ذروة [أو تركيز] FOص حسبت كل سوروس في متوسط ذروة منطقة [أو تركيز] لذلك سوروس، ثم ضرب الناتج في 100) لكل مركب باستخدام منطقة الذروة. لتقييم أهمية تصحيح العينات باستخدام المعيار الداخلي، تم حساب معامل التباين لكل سوروس أيضا باستخدام تركيزات كل سوروس حسابها باستخدام حمض الأديبيك كمعيار داخلي. كما هو متوقع، كان الأسلوب التشيكي قادرة على قياس بدقة SCCAs وحمض الأديبيك، مع COVs 3.02٪ لحامض الستريك، 2.64٪ للحمض الماليك، 3.74٪ لحامض الخليك، وبنسبة 2.01٪ لحمض الأديبيك (حمض اللاكتيك كان أقل من اللد / LOQ لجميع عينات القهوة قياس). تكررت هذه القياسات في فترة لمدة خمسة أيام، وتراوح السير الذاتية 2،11-5،25٪ لحامض الستريك، 2،01-5،32٪ للحمض الماليك، 1،72-3،74٪ لحامض الخليك، و1،26-3،82٪ للحمض الأديبيك. عندما تم تصحيحها المناطق الذروة باستخدام معيار الداخلي وحساب تركيزات سوروس استخدمت لحساب COVs، تراوحت COVs اليوم الواحد ومدمج 1،08-4،17٪ لحامض الستريك، 1،47-3،40٪ للحمض الماليك، و2،68-5،10٪ لحامض الخليك. لتقييم التباين بين اليوم، تم قياس SCCAs في عينة قهوة واحد مرة واحدة يوميا في جميع أنحاء لمدة خمسة أيام. وهذه التجربة ثم يتكرر خمس مرات لكل سوروس وحمض الأديبيك. ثم تم احتساب COV لكل سوروس بقسمة الانحراف المعياري في منطقة ذروة (أو تركيز) لكل سوروس في متوسط الذروة المنطقة (أو التركيز) لأن سوروس وضرب من قبل 100. لتقييم أهمية عينات تصحيح باستخدام داخلي تم حساب مستوى، COVs أيضا باستخدام تركيزات كل سوروس حسابها باستخدام حمض الأديبيك كمعيار داخلي. كانت الطريقة تشيكيا قادرة على إنتاج موثوق القياسات سوروس، مع COVs تتراوح 5،24 حتي 10،02٪ لحامض الستريك، 6،55-9،47٪ للحمض الماليك، 7،67-8،63٪ لحامض الخليك، و3،08-6،57٪ للحمض الأديبيك. عندما تم تصحيحها المناطق الذروة باستخدام معيار الداخلي وحساب تركيزات سوروس استخدمت لكاليفورنياCOVs lculated، تراوحت COVs بين يوم 4،56-6،23٪ لحامض الستريك، 3،39-4،99٪ للحمض الماليك، و9،5-10،94٪ لحامض الخليك.
الشكل 2: مثال PDA يتتبع مع أشارت القمم كانت مخففة عينات القهوة الخضراء 1:10 قبل تحميل في قوارير م. يشار إلى الأحماض من الفائدة: حمض الخليك (A)، وحامض الستريك (C) وحامض اللبنيك (L)، وحمض الماليك (M) ومعيار داخلي، حمض الأديبيك (IS) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
وأجري التحليل الإحصائي على تركيز الأحماض تصحيح باستخدام النموذج الخطي العام (GLM) لتحديد ما إذا كان العلاج غيرت مستويات حمض عضوي. نموذج بشأن إدراج "العلاج" X "تشغيل" (مشفرة كعامل عشوائي) كان implemen تيد لGLM. استخدمت مقارنة، بحث توكي في ثقة 95٪ لتحديد اتجاهها من التغييرات.
العلاج غيرت تركيزات سوروس في القهوة الخضراء. وقد أثرى حمض الخليك بشكل ملحوظ في كل المعاملات على أي سيطرة العلاج (GLM، ف <0.0001).
وكان تأثير العلاج على مستويات حمض عضوي في القهوة الخضراء علاج أي تأثير على (أ) الليمون أو حمض الماليك المستويات في القهوة الخضراء: الرقم 3. ومع ذلك، كل العلاجات بشكل ملحوظ (ب) مستويات حمض الخليك مقارنة مع أي ضوابط العلاج (GLM، P <0.001). وكانت الزيادة في مستويات حمض الخليك أعظم مع ميكروب + العلاج المتوسطة. وتشير الرسائل اختلاف كبير عن طريق مقارنة، بحث توكي في 95٪.e.jpg من "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لوحظ أن أكبر زيادة في ميكروب + وسائل الاعلام العلاج، مما أدى إلى زيادة 0.25 أضعاف (0.5 مقابل 0.4 ملغ / غ قهوة في GCP674 مقابل NT). ولوحظ اتجاه مماثل في مستويات حمض اللاكتيك، على الرغم من أنها لم تكن تختلف كثيرا. لم تكن هناك تغييرات كبيرة أو الاتجاهات في الأحماض الأخرى تتبع (الستريك وحامض الماليك).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو الحال مع أي تقنية تحليلية، وهناك العديد من العوامل الحاسمة التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية وموثوقية البيانات التي تم إنشاؤها. أولا، من المهم معالجة عينات بكفاءة، مع حد أدنى من دورات تجميد / الذوبان. تكرار التجميد والذوبان يمكن أن تعرض للخطر التركيب الكيميائي للعينة قبل المعالجة أو التحليل. ثانيا، من الأهمية بمكان تطبيق الخطوات من هذا البروتوكول إلى جميع العينات باستمرار وبشكل متساو. الأخطاء التقنية الناشئة من إعداد العينات غير متناسقة والتعامل معها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية البيانات التي تم إنشاؤها، ويؤدي إلى زيادة "ضجيج" في قياسات سوروس. على سبيل المثال، فإن حجم الجسيمات من العينة بعد طحن تؤثر على سرعة وكفاءة استخراج سوروس. لذلك من المهم للتأكد من أن العينات الأرض إلى حجم الجسيمات موحدة، حيث سيؤدي ذلك إلى الحفاظ على كفاءة استخلاص عبر العينات ويساعد على الحد من تقلب عينة إلى عينة. سيمilarly، والقياس الدقيق وpipetting لأثناء تحضير محاليل قياسية، القياس الدقيق من الجماهير عينة، والرصد الدقيق (والتطبيع) مرات استخراج يؤدي إلى توليد المزيد من البيانات موحدة. أخذ الوقت لتطبيع بعناية وقياس وتسجيل كل من هذه المعايير وضمان موثوقية البيانات والسماح للدقيقة تصحيح ما بعد التشغيل من البيانات عن أي أخطاء المعالجة التي قد تحدث. ثالثا، من الأهمية بمكان لتحديد واستخدام معيار داخلي المناسب. سوف حسابات تركيز تحليلها النهائي تعتمد بشكل كبير على تصحيح دقيق استنادا إلى منطقة ذروة المعيار الداخلي لوحظ في كل عينة. وبسبب هذا، فمن الأهمية بمكان أن المعيار الداخلي أن يكون كل من قياسها بدقة وعلى وجه التحديد؛ وينبغي من الناحية المثالية لا تحدث بشكل طبيعي في العينة أو زملاء أزل مع غيرها من المركبات. فالامر لا يقتصر على حسن الاختيار واستخدام معيار الداخلي في جميع العينات تمكن الباحث للسيطرة FOص التغيرات في مستويات الأيض لاحظت بسبب الاختلافات في كفاءة الاستخراج. كما أنه يبسط إلى حد كبير التجهيز النهائي وتحديد الذروة. وأخيرا، لا بد من رصد وتحديد الذروة وعملية التكامل. في حين خوارزميات المعالجة الآلية مفيدة، فهي ليست مثالية. البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذه التقنية تعتمد على دقة التكامل، ويجب فحص آثار يدويا لضمان جودة أحداث التكامل، لا سيما تعريف حدود الذروة وخطوط الأساس.
كما هو الحال مع أي إجراء التحليلي، فمن المهم لإثبات أن طريقة التشيكي المقدمة هنا هو: أ. دقة: قادرة على تحديد مبلغ معين سوروس الحاضر. ب. دقة: قادرة على قياس بتكاثر SCCAs في نفس اليوم وفي القياسات التي أجريت في عدة أيام من التحليل؛ وج. قوية: قادرة على استعادة معظم الوقت الحاضر SCCAs في العينات التي تم تحليلها. كما هو مبين أعلاه في الدقة التمثيليةults، الطريقة الموصوفة هنا هو قادر على تحديد دقيق لكميات من SCCAs موجودة في العينات. جميع SCCAs قياس (الستريك، الماليك، حمض الخليك، وحامض اللبنيك) والمعيار الداخلي (حمض الأديبيك) أظهرت استجابة خطية في 0-80 نانوغرام / مجموعة تركيز ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك، تراوح LOQs وLODs لهذه الأحماض 2-4 نانوغرام / ميكرولتر و1-2 نانوغرام / ميكرولتر، على التوالي. وكان الأسلوب أيضا دقيق، حيث أن كل من SCCAs قياس وحمض معيار الداخلية الأديبيك أظهرت انخفاض تقلب اليوم الواحد، وانخفض بين 2،0-5،5٪ من المساحة الذروة (أو بين 1،0-5،2٪ من تركيز محسوب) لجميع SCCAs قياس. كان التباين بين يوم القياسات سوروس أيضا منخفضة نسبيا، وهبوط بين 3،05 حتي 10،10٪ من المساحة الذروة (أو بين 3،30 حتي 10،95٪ من تركيز محسوب) لجميع SCCAs قياسها. ومن المثير للاهتمام، مع استثناء من حامض الخليك، الذي كان على الدوام في أو بالقرب من حدود الكشف / الكمية في جميع عينات القهوة يحللالطبعه، وتصحيح العينات باستخدام حمض الأديبيك كما أدى معيار الداخلي في قياسات أكثر استنساخه وانخفاض في معامل التباين (انظر ممثل النتائج أعلاه). هذه البيانات تتسق مع نتائج نشرت في السابق تشير إلى أن التصحيح مع معيار الداخلية أمر أساسي في الحفاظ على الدقة في CE يحلل على مر الزمن 16. في حين أن بعض الأساليب قد استخدمت الأيونات غير العضوية كمعيار داخلي، شعرنا أن حمض الأديبيك كان المعيار الأنسب لطريقة التشيكي قدم هنا، لأنه هو من الأحماض العضوية وبالتالي أكثر عرضة للتجربة الخسارة في إعداد العينات خطوات مماثلة لتلك التي التي يمر بها SCCAs من الفائدة في العينة. ان حمض الأديبيك مزايا إضافية لا تكون حاضرة في عينات القهوة محل دراسة، واظهار استجابة خطية عبر نفس التركيزات المستخدمة لSCCAs في هذه الدراسة، واظهار منخفضة نسبيا اللد / القيم LOQ (1 نانوغرام / ميكرولتر و 4 نانوغرام / ميكرولتر، على التوالي)، وهودا عالية في المئة استرداد من المصفوفة القهوة (100.19٪ ± 2.57)، مما يجعلها معيارا مفيدا لقياس SCCAs في عينات القهوة. ومن المثير للاهتمام، كان الانتعاش في المئة الملحوظ للحمض الأديبيك تحقيقه لجميع الأحماض العضوية تقاس في هذه الدراسة، التي عرضت القيم الانتعاش في المئة بدءا 91،94-106،08٪. وتشير هذه البيانات إلى أن طريقة التشيكي المقدمة هنا هي قادرة على استرداد أكثر من SCCAs موجودة في عينات القهوة.
التكيف مع هذا البروتوكول لأنواع نموذج جديد يتطلب جمع البيانات الأولية، بناء على الأدب أو الأدلة التجريبية، بشأن المبالغ المتوقعة من التحاليل المستهدفة. هذه المعلومات سوف تساعد في توجيه التصميم التجريبي، وإعداد العينات، وبناء منحنى القياسية. ويمكن تحقيق ذلك بسهولة تجريبيا عن طريق تشغيل سلسلة التخفيف من استخراج اختبار للعثور على تخفيف العمل السليم تحديد عينة تخفيف الصحيحة لاستخدامها. وقد تم تصميم هذا البروتوكول للكشف عنالمبين SCCAs في المثال النتائج، ولكن يمكن بسهولة تكييفه للكشف عن SCCAs أخرى عن طريق تغيير معلمات الفصل، مثل الجهد الانفصال، والضغط، أو الوقت. من المهم أن نتذكر، مع ذلك، أن تغيير معلمات الفصل قد يغير من عدد من يدير هذا يمكن أن يتحقق على مجموعة واحدة من مخازن الانفصال كما تتحلل هذه المخازن مع الاستخدام. تدهور الأساسي أو تغيرات في التيار وغالبا ما تكون مظاهر الإفراط في استخدامها / مخازن المنضب. يمكن استبدال المخزن المؤقت تشغيل وإعادة تكييف الشعرية في كثير من الأحيان حل هذه المشاكل. بعد الاستخدام الموسعة، فإن قدرة الشعرية لحل التحاليل يقلل كذلك. انخفض استقرار خط الأساس، والتحولات الجذرية في الوقت الاحتفاظ، وخفض الذروة قرار كلها علامات التي قد تحتاج إلى استبدال الشعرية. ومن الممكن أيضا أن تظهر رسالة خطأ الضغط الناجم عن الختم غير لائق بين قارورة العينة والشعرية بسبب غطاء قنينة سوء المناسب أو قارورة المعيبة. ضمانالقبعات تناسب بشكل مريح في قارورة العينة لمنع هذا الخطأ.
تقليديا، وقد استخدمت أساليب الكروماتوغرافي مثل GC-MS، GC-ااا، أو HPLC للكشف عن SCCAs في مجموعة واسعة من المصفوفات، بما في ذلك الهواء والماء والتربة والعينات النباتية 14. في حين فعالة، والعيب الرئيسي في هذه الطرق هو الحاجة إلى derivatize SCCAs قبل الكشف. يستخدم اشتقاق الكواشف الخطرة والحد من الكشف غالبا ما تتأثر كفاءة اشتقاق رد فعل 13،14. الكشف عن SCCAs غير derivatized من خلال تشيكيا يتجنب خسارة تحليلها أثناء المعالجة، التعرض للعوامل derivatizing الخطرة، ويقلل من الوقت اللازم لإعداد عينة. ويمكن رؤية هذه المزايا في ارتفاع معدلات استرداد الكلفة في المئة (تتراوح بين 91،94-106،08٪) المحسوبة لجميع SCCAs تقاس في هذه الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، تشيكيا الكمي لSCCAs يحقق حدود الكشف مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدب لGC-MS، GC-ااا، وHPLC، في نطاق سأجزاء و لكل مليون إلى أجزاء في البليون 13،14. عندما يقترن مع أوقات تشغيل عالية السرعة، وقوة فصل عالية الدقة، وبروتوكولات تجهيز العينات على التوالي إلى الأمام التي تستخدمها هذه الطريقة في التحليل، وحساسية وراحة تشيكيا جعله بديلا جذابا لطرق GC أو HPLC التقليدية.
ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أنه في حين يوفر تشيكيا العديد من المزايا GC-MS HPLC، أو LC-MS / MS على أساس أساليب تحليل سوروس، أنه ليس من المناسب ليحلل كل سوروس. على سبيل المثال، منذ طريقة التشيكي الموصوفة هنا يعتمد فقط على الكشف الطيفي، فإنه لا يسمح لتحديد SCCAs غير معروفة الموجودة في العينة، أو تأكيد الهوية سوروس عبر التنميط الطيفي الشامل. وبسبب هذا، فإن أساليب GC-MS أو LC-MS / MS يكون أكثر ملاءمة للسوروس يحلل في عينات تحتوي على أعداد كبيرة من SCCAs غير معروفة، أو عينات التي من المهم جدا للتأكد من هوية كل SCCAs الحالية.بالإضافة إلى ذلك، على أساس أساليب كما ذكرت سابقا LC-MS / MS تسمح للحدود الدنيا من الكشف (LODs) متوسط -on، 0.05 ميكروغرام / مل LC-MS / MS 17 مقابل 1 ميكروغرام / مل لتشيكيا الحصول عليها باستخدام أسلوب المقدمة هنا-LC-MS / MS الكمي القائم من SCCAs قد تكون أكثر ملاءمة للعينات التي SCCAs هي موجودة بكميات منخفضة جدا أو تعقب.
يركز بروتوكول المقدمة هنا على استخراج وتقدير من سلسلة قصيرة من الأحماض الكربوكسيلية (SCCAs) من الأنسجة النباتية. والحصول على الكفاءة في هذه التقنية تفتح الباب أمام مجموعة واسعة من تطبيقات هذه التكنولوجيا للباحث الفردية. هذه التقنية، مع وجود اختلافات طفيفة فقط في المنهجية، وقد استخدمت بنجاح في تحليل SCCAs في مجموعة متنوعة من السكان من العينات وركائز، بدءا من المنتجات الغذائية وعينات الأنسجة لالبيئية للمياه وعينات من التربة 8. بالإضافة إلى ذلك، كسب الألفة مع مديري الكيميائية الكامنةوهذه التكنولوجيا على الرغم من هذا البروتوكول يوفر للباحثين قاعدة المعرفة اللازمة لمحاولة تحليل مركبات أخرى، مثل الكربوهيدرات أو المعادن 8،13. المرونة التحليلية الكهربائي الشعرية يجعلها أداة قوية للغاية ومناسبة لعدد لا يحصى من التطبيقات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
