Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
У больных с ограниченным числом метастазов в печени и медленных темпов прогрессирования можно успешно лечить с местным лечением приближается к 1,2. Тем не менее, мало известно о гетерогенности метастазов в печени, а также на животных моделях, способных оценить развитие отдельных метастатических колоний необходимы. Здесь мы представляем улучшенную модель метастазов в печени, что обеспечивает возможность количественно визуализировать развитие отдельных опухолевых клонов в печени и оценить их кинетики роста и эффективности колонизации. Мы создали панель моноклональных производных HCT116 раковых клеток человека колоректального стабильно меченных люциферазы и tdTomato и обладающих различными свойствами роста. С селезеночной инъекции с последующим спленэктомии, большинство из этих клонов способны генерировать метастазами в печени, но с различными частотами колонизации и различной скоростью роста. Использование Syste В визуализации in vivoм (ИВИС), можно визуализировать и количественно развитие метастаз с люминесцентными в естественных условиях и исключая виво флуоресцентных изображений. Кроме того, Диффузный Люминесцентные визуализации томография (DLIT) обеспечивает 3D распределение метастазов в печени в естественных условиях. Ex естественных условиях флуоресцентной визуализации добываемых печени обеспечивает количественные измерения отдельных печеночных метастатических колоний, что позволяет для оценки частоты колонизации печени и кинетики роста метастазов. Так как модель аналогична клинически наблюдаемых метастазов в печень, он может служить в качестве механизма для выявления генов, связанных с метастазами печени, а также для тестирования потенциальных абляционные или вспомогательной терапии для лечения болезни печени метастазами.
Introduction
У больных с метастазами в печень от первичных колоректального рака (КПР) характеризуются неблагоприятным прогнозом. Уровень 5-летней выживаемости для первичных неметастатическим CRC (этапы I – III) оценивается в 75 – 88% 3,4, в то время как у пациентов с метастазами в печени (стадия IV) имеют 5-летняя выживаемость составляет всего 8 – 12% 5 , 6. Тем не менее, у пациентов с метастазами представляют собой разнородную группу, представляя с различным числом метастазов и рецидивов разное время. Клинические наблюдения показывают , что количество метастазов (которое может быть пропорционально колонизируя способности или частоты колонизации) и размер любого отдельного метастаз (пропорциональной локальной скорости роста) являются независимыми прогностическими факторами 1,7. Другими словами, успех метастатических клонов колонизаторов печени зависит от двух основных свойств: их способность расти и их способность распространять и выживать в микросреде печени.
Дизайниз успешных клинических моделей с возможностью захвата и количественной оценки свойств метастатических клонов может существенно улучшить наше понимание печени метастаз биологии и обеспечить эффективный инструмент для разработки потенциальных терапевтических подходов. Модели экспериментальной метастазов в печени были ранее сообщалось 8,9, но ни один из них предоставил возможность количественно фиксировать и описывать свойства отдельных метастатических клонов , как в естественных условиях и бывших естественных условиях.
Здесь мы представляем новую, современную модель метастаз печени, которая включает генерацию опухолевых клонов с различной эффективностью колонизация печени и ростовые свойства. Мы использовали сочетание двойного мечения раковых клеток с люциферазы и tdTomato флуоресцентного белка с поколением моноклональных клеточных линий, которые имеют внутренние различия в метастатической способности. В этой экспериментальной модели, данные показывают, что развитиеметастазы в печень могут быть описаны в терминах частоты колонизацию и время удвоения (Td), что согласуется с клиническими наблюдениями. Количественный характер этой модели делает его легко оптимизируется для открытия новых лекарств и диагностических целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Животная модель представлена в нынешнем докладе, основывается на двух основных подходов. Во- первых, с тем чтобы обеспечить возможность наблюдать метастатических клонов с различными наклонностей колонизировать и размножаться в печени, была создана группа из сильно неоднородных л?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джеффри Л. Грин (Университет Чикаго) для плазмиды Luc2-tdTomato и линии клеток НСТ116, г-н Ани Соланки (Animal Resource Center) для управления мышей, и д-р Лара Leoni за помощь с DLIT. Количественными флуоресцентных и люминесцентных интенсивностей были выполнены в Комплексном мелких животных Imaging Research Resource в Университете Чикаго в IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Эта работа была поддержана Вирджинии и DK Людвиг фонд исследований рака, легких Cancer Research Foundation (КЗоТ), Фонд рака простаты (PCF) и онкологический центр поддержки Грант (P30CA014599). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O’Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
