Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
I pazienti con un numero limitato di metastasi epatiche e dei tassi di lenti di progressione possono essere trattati con successo con trattamento locale approcci 1,2. Tuttavia, poco si sa circa l'eterogeneità delle metastasi epatiche, e sono necessari modelli animali in grado di valutare lo sviluppo delle singole colonie metastatiche. Qui, vi presentiamo un modello avanzato di metastasi epatiche che offre la possibilità di visualizzare quantitativamente lo sviluppo dei singoli cloni tumorali nel fegato e stimare la cinetica di crescita e l'efficienza colonizzazione. Abbiamo generato un gruppo di derivati monoclonali di cellule tumorali del colon-retto umano HCT116 stabile etichettati con luciferasi e tdTomato e che presentano caratteristiche diverse di crescita. Con un'iniezione splenica seguita da una splenectomia, la maggioranza di questi cloni sono in grado di generare metastasi epatiche, ma con differenti frequenze di colonizzazione e tassi di crescita variabili. Utilizzando il Syste imaging in vivom (IVIS), è possibile visualizzare e quantificare lo sviluppo di metastasi con luminescenti in vivo ed ex vivo di imaging fluorescente. Inoltre, Diffuse Luminescent Imaging Tomografia (DLIT) fornisce una distribuzione 3D di metastasi epatiche in vivo. Ex vivo l'imaging fluorescente fegati raccolte fornisce misurazioni quantitative delle singole colonie metastatiche epatiche, consentendo la valutazione della frequenza di colonizzazione fegato e la cinetica di crescita di metastasi. Dal momento che il modello è simile a metastasi epatiche clinicamente osservati, può servire come una modalità per la rilevazione di geni associati con metastasi epatiche e per testare potenziali trattamenti ablativi o coadiuvanti per la malattia metastatica epatica.
Introduction
I pazienti con metastasi epatiche da tumori colorettali primari (CRC) sono caratterizzate da una prognosi infausta. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i primari non metastatici CRC (fasi I – III) è stimato in 75-88% 3,4, mentre i pazienti con metastasi epatiche (stadio IV) hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l'8 – 12% 5 , 6. Tuttavia, i pazienti metastatici rappresentano un gruppo eterogeneo, che presenta con diverso numero di metastasi e diversi tempi di ricorrenza. Osservazioni cliniche indicano che il numero di metastasi (che può essere proporzionale alla capacità colonizzazione o la frequenza di colonizzazione) e la dimensione di ogni singola metastasi (proporzionale al tasso di crescita locale) sono fattori prognostici indipendenti 1,7. In altre parole, il successo di cloni metastatici che colonizzano il fegato dipende da due importanti caratteristiche: la loro capacità di crescere e la loro capacità di diffondere e sopravvivere nel microambiente del fegato.
Il designmodelli di successo clinici con la capacità di catturare e quantificare le proprietà di cloni metastatiche può migliorare drasticamente la nostra comprensione di fegato metastasi biologia e fornire uno strumento efficace per la progettazione di potenziali approcci terapeutici. Tutti i modelli di metastasi epatiche sperimentale sono stati precedentemente segnalati 8,9, ma nessuno dei due fornito la capacità di catturare e descrivere le caratteristiche dei singoli cloni metastatici sia in vivo e ex vivo quantitativamente.
Qui, vi presentiamo un nuovo, modello avanzato di metastasi epatiche che include la generazione di cloni tumorali con diverse efficienze di colonizzazione del fegato e proprietà di crescita. Abbiamo utilizzato una combinazione di dual-etichettatura delle cellule tumorali con luciferasi e proteina fluorescente tdTomato con la generazione di linee cellulari monoclonali che hanno differenze intrinseche nella capacità metastatica. In questo modello sperimentale, i dati indicano che lo sviluppo dimetastasi epatiche possono essere descritti in termini di frequenza di colonizzazione e tempo di raddoppio (Td), che è coerente con osservazioni cliniche. La natura quantitativa di questo modello lo rende facilmente adottabile per la scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello animale presentato nella presente relazione si basa su due approcci principali. In primo luogo, al fine di assicurare la capacità di osservare cloni metastatici con differenti inclinazioni di colonizzare e proliferare nel fegato, un pannello di linee cellulari monoclonali altamente eterogenei è stato istituito, piuttosto che una consolidata linea cellulare di tumore non frazionata 12,13. L'approccio monoclonale per lo sviluppo di metastasi è giustificato dai recenti dati genomici 14</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott Geoffrey L. Greene (Università di Chicago) per il plasmide luc2-tdTomato e la linea cellulare HCT116, Mr. Ani Solanki (Resource Center Animale) per la gestione topi, e il Dr. Lara Leoni per l'assistenza con il DLIT. Quantificazioni di intensità di fluorescenza e luminescenti sono stati eseguiti in Small Animal Imaging integrata delle risorse di ricerca presso l'Università di Chicago su un Spectrum IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Virginia e Fondo Ludwig DK per la ricerca sul cancro, il Lung Cancer Research Foundation (LCRF), il Prostate Cancer Foundation (PCF), e il Cancer Center Support Grant (P30CA014599). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
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