전이성 클론이 먼 곳에 군체를 형성할 수 있는 능력은 증식 능력 및/또는 숙주 미세환경에서 상당한 증식 없이 생존할 수 있는 능력에 달려 있습니다. 여기에서는 전이성 클론에 의한 두 가지 유형의 간 집락화를 정량적으로 시각화할 수 있는 동물 모델을 제시합니다.
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방법 논문
고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
간 및 전이 진행의 느린 속도의 제한된 수의 환자는 성공적으로 치료 로컬로 처리 될 수 1,2- 접근한다. 그러나, 약간의 간 전이의 이질성에 대해 알려져 있으며, 개별 전이성 콜로니의 발달을 평가 할 수있는 동물 모델이 필요하다. 여기서는 정량적 간에서 개별적인 종양 클론의 개발을 시각화하고 성장 동역학 및 정착 효율을 추정하는 능력을 제공 간 전이의 고급 모델을 제시한다. 우리는 안정적으로 루시 페라 제와 tdTomato 다른 성장 특성을 갖는으로 표시 HCT116 인간 대장 암 세포의 단일 클론 파생 상품의 패널을 생성합니다. 비장 절제술 다음 비장 주입,이 클론의 대부분의 간 전이를 생성 할 수 있지만, 다른 주파수의 정착 및 가변 성장률이다. 생체 내 이미징 SYSTE 사용m (IVIS)는, 그것을 시각화 생체 발광 및 생체 형광 이미징 전이 현상을 정량화 할 수있다. 또한, 확산 발광 이미징 단층 촬영 (DLIT)는 생체 내에서 간 전이의 3 차원 분포를 제공한다. 수확 간의 전 생체 내 형광 이미징은 개인 간 전이성 식민지의 정량적 측정을 제공, 간 식민지의 주파수의 평가와 성장 속도론을 허용 전이. 모델 임상 관찰 간전이 비슷하기 때문에, 간 전이와 연관된 유전자를 검출하기위한 간 전이성 질환 전위 융제 또는 보조제 치료를 시험하는 양상이 될 수있다.
서론
차 대장 암 (CRC)에서 간 전이 환자는 예후가 불량 특징으로한다. 12 % - 5 간전 (단계 IV)을 가진 환자가 단지 8의 5 년 생존율이 동안 88 % 3,4 - 기본 nonmetastatic CRC에 대한 5 년 생존율 (단계는 I - III) (75)으로 추정 6. 그러나, 전이성 환자는 전이 및 다른 재발 시간의 서로 다른 숫자를 제시, 이종 그룹을 나타냅니다. 임상 관찰과 (지역 성장 속도에 비례) 단일 전이의 크기 (식민지 능력 또는 식민지의 주파수에 비례 할 수 있음) 전이의 수는 독립적 인 예후 인자 1,7가 있음을 나타냅니다. 성장 능력과 전파 및 간 미세 환경에서 생존 능력 : 즉, 간 식민지화 전이성 클론의 성공은 두 가지 특성에 의존한다.
디자인캡처 크게 간 전이 생물학에 대한 우리의 이해를 향상시키고 잠재적 인 치료 접근 방법의 설계를위한 효과적인 도구를 제공 할 수 있습니다 전이성 클론의 특성을 정량화의 기능이 성공적으로 임상 모델. 실험 간전 모델 이전 8,9보고되었지만, 이들 중 어느 정량적 캡처 생체와 생체 외 모두 개별 전이성 클론의 특성을 설명하는 기능을....
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프로토콜
모든 동물의 절차는 시카고 대학 (프로토콜 # 72213-09)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 무균 조건 하에서 수행 하였다.
1. 준비
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100mg / ml 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) : 500 HCT116 종양 세포의 배양을위한 배지의 용액을 만든다.
- 20 분 동안 251 ° F에서 4 수술 타월, 거즈, 두 개의 작은 Adson 픽업, 바늘 구동부 위 두 쌍 작은 클램프 3 microclips - 악기 3 등 비장 주입 모델에 사용되는 오토 클레이브 .
- , 마우스에 대한 수술 후 마취를 준비 비장 주입 다음 피하 투여 할 수 있습니다. 마우스 당 0.9 생리 식염수 500 μL에 부 프레 노르 핀의 4 μg의 - 2 희석.
- 복강 내 주사 지속 시간에 대한 반디 루시페린의 150 μg의 / 150 μL의 분취 량을 준비생물 발광 분석을 보내고. -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다.
루시 페라 제 / tdTomato 표지 단일 클론 셀 라인 10, 11를의 2 세대
- 해동 HCT....
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결과
이 실험의 목표는. 생체 전이성 종양 부담 직렬 정량화하고 식민 주파수 간 전이 현상의 성장 동역학의 추정의 가능성과 일관된 쉽게 재현 동물 모델을 확립 하였다 2-6도 전설로, 크리에이티브 커먼즈 CC-BY 라이센스 (10)에 따라 이전 출판물에서 제공됩니다.
더블 표지 종양 세포 단일 클론의 생성
첫째, 발광 및 형광 표지 된 모노클로 날 세포주의 패널은 서로 다른 전이 능력을 생성 하였다. 부모의 HCT116의 대장 암 세포에서 성공 발광의 형질 (Luc2) 및 형광 (tdTomato) 단백질에 이어, 16 번 표지 단일 클론은 부모의 HCT1을 희석하여 생성 된1 세포 / 96 웰 플.......
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토론
현재 보고서에 기재된 동물 모델은 두 가지 방식에 기초한다. 우선, 정착 및 간에서 증식 다른 성향과 전이성 클론을 관찰 할 수있는 기능을 보장하기 위해 높은 이종 모노클로 날 세포주 패널 오히려 설정된 분획 암 세포주 12,13보다 설립되었다. 전이 현상에 대한 단일 클론 방식은 최근의 게놈 데이터 (14)에 의해 정당화되고, 성공적 전이성 10,15,16 프로세스를 모델링 이전에 사용되었다. 둘째, 루시 페라 제 및 tdTomato 마커에 의해 부모 세포주의 이중 라벨은 전이성 성장 생체 내 및 생체 외 모두의 향상된 분석을 제공하기 위해 설립되었습니다. 발광 및 형광 표식 상세한 해부 검사 간 colonizatio의 주파수 또는 효과로 간주 전이성 종양의 양 둘 다의 전위 부량 (허용N) 및 개별 식민지의 크기입니다. 후자 용이 단계 2에 기재된 간단한 보정 절차를 사용하여 셀의 실제 개수로 변환이 <.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 Luc2-tdTomato 플라스미드와 HCT116 세포주의 도움 씨 애니 Solanki (동물 자원 센터) 쥐 관리, 박사 라라 레오니 박사 제프리 L. 그린 (시카고 대학)에 감사드립니다 DLIT와. 형광 및 발광 강도의 정량화는 IVIS 스펙트럼에 시카고 대학 (퍼킨 엘머, 홉 킨톤, MA)에 통합 작은 동물 영상 연구 자원에서 수행되었다. 이 작품은 암 연구를위한 버지니아와 DK 루드비히 기금에 의해 지원되었다, 폐 암 연구 재단 (LCRF), 전립선 암 재단 (PCF) 및 암 센터 지원 그랜트 (P30CA014599). 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IVIS Spectrum In Vivo 이미징 시스템 | 캘리퍼 생명 과학 | 124262 | In Vivo 이미징 시스템 |
| LivingImage 4.0 소프트웨어 | 캘리퍼 생명 과학 | 128165 | 이미징 소프트웨어 |
| VAD-MGX 연구 마취기 | Vetamac | VAD-MGX | 흡입 마취기 |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | 세포 배양 시약 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | 세포 배양 시약 |
| 페니실린/스트렙토마이신, 액체(10,000 단위 페니실린; 10,000 &뮤; g 스트렙토마이신) | 인비트로젠 | 15140163 | 세포 배양 시약 |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | 세포 배양 시약 |
| 부프레넥스 주사 (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 부프레노르핀 염산염 |
| 제미니 소작 시스템 | Braintree Scientific | GEM 5917 | 비장 절제술용 휴대용 소작 |
| 마이크로 클립; 곧장; 70g 압력; 1.5mm 클립 너비; 10mm 턱 길이 | Roboz 수술 기구 | RS-5426 | Hemoclip: 비장 주사 후 지혈 기구 |
| D-루시페린, 칼륨염 | Goldbio Technology | LUCK-1G | 루시페린 칼륨염 |
| Opti-MEM I 환원 혈청 매체 | Gibco | 31985062 | 환원 혈청 매체 |
| TC20 자동 세포 계수기 | BIO-RAD | 1450102 | 자동 세포 계수기 |
| JMP10 소프트웨어 | SAS Institute | 데이터 분석 소프트웨어 | |
| BD FACSAria II 세포 분류기 | BD Biocsiences | 세포 분류기 |
참고문헌
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al.
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재인쇄 및 허가
