Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
La struttura quaternaria di una proteina gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Vie di segnalazione, l'espressione genica, e l'enzima di attivazione / disattivazione tutti si basano sul corretto montaggio di complessi proteici 1-4. Questo processo noto anche come omo- o etero-oligomerizzazione è dovuta a covalente irreversibile o reversibile interazioni proteina-proteina elettrostatiche e idrofobiche. Oligomerizzazione non solo diversifica i diversi processi cellulari senza aumentare le dimensioni del genoma, ma fornisce anche una strategia di proteine per costruire complessi stabili che sono più resistenti verso denaturazione e degradazione 5. Difetti di oligomerizzazione hanno un impatto sulla funzione delle proteine e può portare allo sviluppo di malattie. Ad esempio, l'enzima fenilalanina idrossilasi forma un complesso tetrameric. Alcune mutazioni all'interno del complesso proteico possono indebolire la formazione tetramero e portare alla fenilchetonuria malattia 6.
<p class = "jove_content"> La proteina MxA umano è un interferone (IFN) indotta antivirale proteine effettrici esercitando una vasta attività antivirale contro vari RNA così come virus a DNA 7. Essa appartiene alla superfamiglia delle grandi GTPasi Dynamin-like e ha la capacità di formare grandi strutture oligomeriche in vitro 8. L'oligomerizzazione è stato suggerito per proteggere MxA dalla rapida degradazione 9,10. Nonostante intensi sforzi da molti gruppi di ricerca, il meccanismo molecolare di azione rimane in gran parte sfuggente e il ruolo dello Stato oligomerizzazione di MxA per la sua funzione antivirale è in discussione 9,11,12. A questo proposito, Gao e colleghi hanno proposto un modello in cui MxA esercita la sua attività antivirale interagendo con nucleoproteine virali in forma di grandi strutture oligomeriche anulari 11. Tuttavia, più di recente, abbiamo dimostrato che dimeri MxA mostrano attività antivirale e interagiscono con la nucleoproteina del virus A 12. Based sulla struttura cristallina di MxA, Gao e colleghi hanno individuato diversi residui di amminoacidi nelle regioni di interfaccia che sono critiche per la sua oligomerizzazione in vitro e la sua funzione antivirale 11,13. Pertanto, al fine di chiarire che oligomerica stato di MxA esercita attività antivirale, abbiamo cercato di creare un semplice protocollo per determinare rapidamente lo stato di oligmeric MxA mutanti interfaccia espressi nelle cellule umane, così come endogena MxA espresso dopo la stimolazione IFNα.Anche se ci sono molte tecniche che vengono comunemente utilizzati per studiare l'interazione tra le proteine come la proteina split-verde fluorescente (split-GFP) saggio di complementazione 14, risonanza plasmonica di superficie 15 e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) 16, non forniscono informazioni dell'esatta stechiometria di un complesso proteico oligomerica. Per indagare questo particolare aspetto, tecniche comemulti-angolo di diffusione della luce (MALS) 17 e ultracentrifugazione analitica 18 sono molto utili. Di solito, le proteine analizzate utilizzando questi metodi sono proteine purificate. processi di oligomerizzazione può dipendere anche da altri fattori cellulari. Se questi fattori non sono noti, l'analisi è più difficile. Inoltre, alcune proteine sono difficili da esprimere in E. coli e purificare. Pertanto, questi metodi non sono la scelta ottimale per analizzare oligomerizzazione proteina nel ambiente cellulare. Inoltre, queste tecniche richiedono strumenti costosi che non sono facilmente disponibili.
Non denaturante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), cromatografia ad esclusione sterica o reticolazione chimica seguita da convenzionale sodio dodecil solfato (SDS) -pagina sono strumenti utili per la caratterizzazione della formazione di oligomeri da lisati cellulari 2,19,20. Questi metodi non richiedono attrezzature specializzate e possono essere facilmente performed in un laboratorio standard. Inizialmente abbiamo valutato vari protocolli di reticolazione chimici che invariantly hanno portato alla non-specifica aggregazione e la precipitazione di MxA. Pertanto, la prossima testato protocolli PAGE non denaturazione. Come non-denaturazione PAGE esclude l'uso di SDS, la migrazione delle proteine dipende dalla loro carica nativa. Blue-native PAGE utilizza brillante Coomassie G250 blu per caricare proteine con una carica negativa complessiva, simile a SDS, ma non denatura la proteina 21. Purtroppo, brillante Coomassie precipitati blu in presenza di alte sali e cationi bivalenti (ad esempio Mg 2+) che sono spesso inclusi nei buffer di lisi. A seconda dei buffer utilizzati, può essere difficile analizzare il campione senza ulteriore ottimizzazione di passi che potrebbero avere un effetto sul complesso proteico oligomerica.
Qui vi presentiamo un protocollo semplice basato su un metodo precedentemente pubblicato 22 per determinare oligomerizzazione diproteina umana MxA derivate da lisati cellulari utilizzando non-denaturazione PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un semplice metodo che permette la rapida determinazione dello stato oligomerico di proteine espresse in cellule di mammifero mediante PAGE non denaturante seguita da analisi Western blot. Il principale vantaggio di questo approccio è che lo stato oligomerico di una data proteina può essere determinata da lisati cellulari totali senza purificazione della proteina prima. Ciò può essere importante per proteine che oligomerize o esercitano la loro funzione in associazione con fattori ausilia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
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