Summary

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Published: January 25, 2017
doi:

Summary

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Abstract

topi reporter sono stati ampiamente utilizzati per osservare la localizzazione di espressione dei geni target. Questo protocollo si concentra su una strategia per stabilire un nuovo modello di topo transgenico giornalista. Abbiamo scelto di visualizzare interleuchina (IL) 22 genica perché questa citochina ha importanti attività nell'intestino, dove contribuisce a riparare tessuti danneggiati da infiammazione. Sistemi Reporter offrono notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dei prodotti in vivo. Nel caso di IL-22, altri studi avevano prima isolato cellule dai tessuti e poi ri-stimolate le cellule in vitro. IL-22, che è normalmente secreta, è stato intrappolato all'interno delle cellule usando un farmaco e la colorazione intracellulare è stato usato per visualizzarla. Questo metodo identifica le cellule capaci di produrre IL-22, ma non ne determina che facevano così in vivo. Il design giornalista comprende l'inserimento di un gene per una proteina fluorescente (tdTomato) nel IL-22 gene in tale way che la proteina fluorescente non può essere secreto e quindi rimane intrappolata all'interno delle cellule che producono in vivo. Produttori fluorescenti possono quindi essere visualizzati in sezioni di tessuto o ex vivo analisi tramite citometria a flusso. Il processo di costruzione vera e propria per il giornalista incluso recombineering un cromosoma artificiale batterico che conteneva il gene IL-22. Questo cromosoma multistrato è stato poi introdotto nel genoma del mouse. Omeostatico IL-22 espressione reporter è stato osservato in diversi tessuti di topo, tra cui la milza, timo, linfonodi, le placche di Peyer, e intestino, mediante citometria a flusso di analisi. La colite è stata indotta da cellule T (CD4 + CD45RBhigh) di trasferimento, ed espressione reporter è stato visualizzato. Le cellule T positive erano prima presenti nei linfonodi mesenterici, e quindi hanno accumulato all'interno della lamina propria delle piccole tessuti dell'intestino e del colon distale. La strategia con BAC ha dato espressione giornalista buona fedeltà rispetto a IL-22 Expressione, ed è più semplice di procedure knock-in.

Introduction

Cellule specifiche del tipo di espressione di geni reporter è utile per identificare le cellule che esprimono attivamente il target in tessuti sotto stati omeostatiche e perturbate. Permette anche per la purificazione di queste cellule, che rimangono vitali, per studiare le altre proprietà. topi reporter sono stati utilizzati nel chiarire il meccanismo di azione di specifiche citochine, fattori di trascrizione, e elementi regolatori. Strategie Precedente 1, 2, 3 sono in gran parte affidamento sul battendo il giornalista nel locus bersaglio nel topo cromosoma, una procedura che richiede tempo e costosa. Così, un metodo semplice per la generazione di topi transgenici è desiderabile.

Le citochine sono una vasta classe di piccole proteine ​​secrete / peptidi che regolano le risposte immunitarie attraverso la segnalazione intercellulare. L'interleuchina 22 (IL-22) è una citochina con molte riferito attività, tra cui barriera function, la riparazione dei tessuti e l'infiammazione 4. Sebbene IL-22 è stato inizialmente scoperto come prodotto delle cellule T 5, rapporti successivi hanno dimostrato la sua espressione nelle cellule natural killer (NK) negli esseri umani 6 e 7 topi e in altre classi di linfociti innate 8. Nonostante vasta osservazione di cellule-22 che producono IL, visualizzazione di IL-22 in precedenza necessaria la stimolazione ex vivo e permeabilizzazione alle macchie con anticorpi. Pertanto, il romanzo IL-22 topi reporter sarebbe uno strumento molto utile per studiare la funzione di IL-22 nei processi omeostatici e patogeni.

Qui, abbiamo sviluppato un modello semplificato transgenico giornalista mouse per osservare le cellule IL-22-producono in vivo e in vitro. Utilizzando un metodo BAC recombineering 9, abbiamo inserito la sequenza tdTomato cDNA con Poly A frammenti di segnale in IL-22 locnoi e sostituito esone 1. Le altre regioni, esoni, e gli elementi normativi non tradotte non sono stati perturbati, dal momento che vorremmo imitare la regolazione naturale della IL-22, per quanto possibile. Il sito di inserimento giornalista interrompe la sequenza di segnale, con conseguente accumulo del reporter all'interno delle cellule che producono, a differenza di IL-22 stessa, che sta rapidamente secreto. Questo nuovo metodo può essere applicato anche alla generazione di topi transgenici per altre proteine ​​secrete.

Protocol

Tutti gli animali hanno ricevuto cure adeguate secondo le procedure sperimentali descritte nella Guida 2011 per cura e l'uso di animali da laboratorio Comitato di Federico Laboratorio Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 1. Generazione di IL-22-tdTomato topi reporter di BAC recombineering NOTA: I topi dovrebbero essere inconscia e non si muovono in risposta a uno stimolo nocivo. Sterilizzare l'area chirurgica con il 70% di etanolo e sterilizzare tutti gli s…

Representative Results

Un murino IL-22 giornalista transgene è stata creata usando recombineering per modificare un cromosoma artificiale batterico portando la IL-22 locus. La figura 1 mostra uno schema di pBACe3.6 vettore contenente il gene sacBII, un indicatore positivo-selezione, e cloramfenicolo antibiotico gene di resistenza 11. Dopo aver introdotto tdTomato in esone 1, la sequenza di peptide segnale è stato interrotto, come mostrato nella Figura…

Discussion

IL-22 svolge un ruolo essenziale nella innata difesa ospite e nel rimodellamento tissutale. Cellule-22 producono IL sono stati identificati ex vivo mediante colorazione intracellulare. Tuttavia, rimane ancora difficile da monitorare l'espressione di IL-22 in situ, sia allo stato normale o in condizioni infiammatorie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo per sviluppare un modello di topo IL-22 giornalista, che ci permette di localizzare le cellule giornalista esprimono in vivo. La cod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Materials

RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

References

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Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

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