Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo
Summary
arritmias cardíacas hereditárias são geralmente causadas por mutações que alteram a entrega de superfície de um ou mais canais de íons. Aqui, nós adaptar ensaios de citometria de fluxo para proporcionar uma quantificação da expressão de proteína total e a superfície celular relativa dos canais de iões recombinantes expressas em células TSA-201.
Abstract
Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.
Introduction
Este documento proporciona um ensaio fiável para relatar a expressão na superfície celular relativa das proteínas de membrana, tais como canais de iões expressos em células recombinantes que utilizam a tecnologia de citometria de fluxo existente. canais de iões são proteínas de membrana de poros de formação que são responsáveis por controlar os sinais eléctricos por gating o fluxo de iões através da membrana celular. Eles são classificados pelo mecanismo de ativação, natureza, e seletividade de espécies de íon de trânsito através do poro onde eles estão localizados. Nos níveis celulares e teciduais, os fluxos de iões macroscópicas através de canais iónicos são o produto de imóveis 1 biofísico (gating e permeação), bioquímicos (fosforilação) e biogênese (síntese, glicosilação, tráfico e degradação). Cada um destes processos é único para cada tipo de canais iónicos e é optimizado para desempenhar o papel fisiológico do canal de iões. Consequentemente, as alterações em qualquer um destes processos afinadas através de umherdada ou uma modificação genética, muitas vezes referida como "canalopatia", pode ser prejudicial para a homeostase celular. É importante salientar que entregar a quantidade "certa" dos canais de íons na superfície da célula é fundamental para a homeostase celular. Mesmo pequenos aumentos (ganho de função) e pequenas diminuições (perda de função) em actividade de canal iónico tem o potencial de causar uma patologia grave ao longo da vida. Os defeitos na superfície da célula de entrega dos canais de iões maduros é um determinante importante em numerosos canalopatias, tais como a fibrose cística (CFTR canal de iões) 2 e arritmias cardíacas de forma a síndrome de QT longo (canais de potássio cardíacos) 3.
Canalopatias estão associadas à morte súbita cardíaca 4. A prevalência mundial atual de todos os canalopatias cardíacas é pensado para ser, pelo menos, 1: 2,000-1: 3.000 por pessoa 5 e são responsáveis por cerca de metade da súbita por arritmia ca morte cardíacases 6. Disfunção cardíaca na voltagem-sódio, potássio, cálcio e canais iônicos seletivos são conhecidos por desempenhar um papel fundamental neste processo. O 1.2 canais de cálcio voltagem-L-type Ca V é necessária para iniciar a contração do músculo do coração sincronizados. A cardíaca L-type Ca V 1.2 canal é um complexo de proteínas multi-subunidade composta de o principal formador de poros Ca subunidade V α1 e Ca V ß e Ca V α2δ1 subunidades auxiliares 7-12. Note-se que o complemento total de subunidades auxiliares é necessário para produzir funcionais Ca V 1.2 canais na membrana plasmática e interacções dinâmicas entre as subunidades são essenciais para suportar a função eléctrica normal do coração 13. Ca V SS promove a expressão na superfície celular de Ca V 1.2 canais através de um não-covalente nanomolar de interacção hidrófoba 14. A co-expressão do Ca V Wi subunidade α2δ1th Ca V ß-bound Ca V α1 estimula a expressão corrente de pico (de 5 a 10 vezes) e promove a ativação do canal em voltagens mais negativas. Ganho de função mutações da subunidade formadora de poros Ca V 1.2 têm sido associados com uma forma de arritmias ventriculares chamado síndroma do QT longo de 15 enquanto que uma série de mutações pontuais nas três subunidades principais que formam o tipo L-Ca V canal 1.2 foram identificados em indivíduos que sofrem de arritmias de forma a síndroma QT curto 16,17. canais iônicos são proteínas de membrana que podem ser investigados a partir de um ponto de vista bioquímico (química de proteínas), ou usando ferramentas eletrofisiológicos (máquinas geradoras de corrente) e muitas vezes usando estas abordagens complementares. Eletrofisiologia, em particular de células inteiras patch-fixação, é uma abordagem adequada para elucidar a função de canais iônicos 15, mas não pode resolver modificações no tráfego de proteínas a partir de mudanças em seu biofísicopropriedades. Protein Chemistry tem, no entanto, muitas vezes limitado uso, devido à relativamente baixa expressão de proteínas de membrana grande em relação às proteínas solúveis menores. métodos de alto rendimento robustos usando leitura de fluorescência precisam ser desenvolvidos, a fim de abordar especificamente defeitos de biogênese de proteínas que causam alterações na expressão na superfície celular de canais iônicos.
A citometria de fluxo é uma tecnologia biofísica empregada na contagem de células, a triagem, detecção de biomarcadores e engenharia de proteínas 18. Quando uma solução de amostra de células vivas ou em partículas é injectado num citómetro de fluxo, as células são ordenados numa única corrente que pode ser sondado por sistema de detecção da máquina (Figura 1). O primeiro instrumento de citometria de fluxo produzido em 1956 19 detectada apenas um parâmetro, mas citómetros de fluxo modernos têm múltiplos lasers e detectores de fluorescência que permitem a detecção de mais do que 30 parâmetros fluorescentes 20,21.Filtros e espelhos (óptica de emissão) dirigir a difusão da luz ou luz fluorescente de células a uma rede electrónica (fotodiodo e detectores) que convertem a luz proporcionalmente à sua intensidade. Os dados digitais são analisados usando software especializado e a saída primária é exibido como um gráfico de pontos 21.
Figura 1:. Biophysical princípios de citometria de fluxo de triagem células individuais são empurradas através de um bico sob alta pressão dentro de um fluxo de fluido de revestimento que as move entre um ou mais pontos de interrogação laser. O feixe de luz é desviada por as células que passam e a luz recolhida na direcção para a frente (Forward Scatter, FCS) é enviada para um fotodíodo que converte a luz em um sinal proporcional ao tamanho da célula. A luz também é recolhida em um ângulo de 90 ° para o caminho do laser e enviado para detectores (também chamados de fotomultiplicadores (PMT)).Esta luz é encaminhado através de espelhos dicróicos que permitem a detecção do sinal de dispersão lateral (SSC), que reflecte a granularidade dentro das células, e as emissões fluorescentes excitadas se fluorocromos estão presentes na célula. Três detectores (verde, amarelo e vermelho) são representados com diferentes filtros de banda de comprimento de onda, permitindo a detecção simultânea de diferentes fluorocromos. Os diferentes sinais são digitalizados por um computador externo e convertidos em dados que serão analisados para quantificar as características das células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A capacidade de alto rendimento de citómetros de fluxo foi explorada para quantificar a expressão relativa de membrana do tipo selvagem recombinante e do tipo L dependentes da voltagem tráfico deficiente em Ca V 1.2 canais e subunidades associadas em células vivas. co construções de ADNcDing para as proteínas foram duplamente marcado para realizar simultaneamente um epitopo extracelular não fluorescente que pode ser detectado por um anticorpo conjugado fluorescente impermeável e um fluoróforo intracelular que é constitutivamente fluorescente. Tanto o epitopo extracelular, inserido num loop extracelular da proteína, e o fluoróforo intracelular, inserido depois do terminal C, são convertidas com a proteína. Nesta série de experiências, a proteína V α2δ1 Ca foi manipulada para expressar um epitopo extracelular de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA) detectado por um revestimento impermeável com FITC (isotiocianato de fluoresceína) -conjugated anti-HA e mCherry como o fluororo intracelular intrínseca. Para determinar o nível de expressão na superfície celular relativa do mCherry-Ca V α2δ1 proteína marcada com HA, as células recombinantes que expressam a proteína de fusão foram colhidas após a transfecção, e coradas com FITC-conjugado monoclonal de murganho anti-HA tag de epitopo AntibodY (Figura 2). FITC é um composto fluorescente orgânico que é consideravelmente menor do que os repórteres de enzimas e, portanto, não como susceptível de interferir com a função biológica. mCherry- Ca V α2δ1-HA sobre-expresso em TSA-201cells, produz um aumento de 3 log significativa na fluorescência FITC e mCherry fluorescência em parcelas bidimensionais 22. Uma vez que o epitopo de HA situa-se na porção extracelular da proteína, a intensidade de fluorescência obtida para FITC na presença de células intactas reflectir o índice relativo da expressão na superfície celular de proteína marcada com HA. A acessibilidade do epitopo de HA nas construções é sistematicamente validada medindo o sinal de FITC após permeabilização celular. Esta medida serve também para confirmar a expressão de proteína total normalizado desde as intensidades de fluorescência relativas para FITC estimado em células permeabilizadas são qualitativamente comparáveis com os valores de fluorescência relativa for mCherry medidos sob condições permeabilizadas e não permeabilizadas 22,23. É importante notar que o espectro de fluorescência intrínseca é deslocada para valores mais elevados após permeabilização, mas que o único valor a ser reportada é a alteração na intensidade de fluorescência em comparação com a construção de controlo. mudanças relativas na intensidade de fluorescência para as construções de teste são estimadas utilizando a intensidade de fluorescência ΔMean (ΔMFI) valores para cada fluoróforo (mCherry ou FITC). As experiências são concebidos para medir a intensidade de fluorescência do construto de teste em relação à intensidade de fluorescência da construção de controlo expresso sob as mesmas condições experimentais para limitar as variações na fluorescência intrínseca do anticorpo fluoróforos. Duas proteínas de membrana foram estudados com êxito com este ensaio: a subunidade formadora de poros do tipo L, canal de cálcio dependentes da voltagem V Ca 1,2 e 14,22 de uma série diferente deexperimentos, o auxiliar extracelular Ca V α2δ1 subunidade 22,23. O protocolo seguinte foi utilizado para determinar a expressão na superfície celular do Ca V α2δ1 subunidade do tipo L cardíaca Ca V 1.2 canal sob condições de controlo e após a mutações que afectam a modificação pós-tradução do canal de iões. Sob condições experimentais padronizadas, a fluorescência da superfície celular de FITC aumenta quase linearmente com a expressão de ADNc que codifica para os mCherry-Ca V proteínas α2δ1-HA (Figura 5 de referência 22).
Figura 2:. Representação esquemática da rotulagem total e membrana na citometria de fluxo protocolo experimental O esquema descreve algumas das principais medidas necessárias para quantificar a expressão total e da superfície celular relativa de canais de iões recombinantes por flow citometria. As células são transfectadas com a construção de marcação dupla mCherry-Ca V α2δ1-HA em células (1) TSA-201 e coradas antes ou após permeabilização (2). Dados multiparâmetros são adquiridos em um citômetro de fluxo (3) para a análise multivariada (4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
This flow cytometry-based assay was successfully applied to the measurement of relative total and cell surface levels of fluorescently-labelled pore-forming and associated subunits of voltage-gated calcium channels14,22,26. It is best used when investigating the impact of genetic mutations and thus requires that the intrinsic fluorescence intensity of the fluorescently-labelled tagged wild-type construct be at least 10 to 100-fold larger than for the fluorescence intensity of the fluorescently-labelled untagge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Serge Sénéchal and Dr. Jacques Thibodeau for sharing their expertise and granting us access to their flow cytometry and cell sorting platform. This work was completed with the operating grant 130256 from the Canadian Institutes of Health Research, a grant-in-aid from the Canadian Heart and Stroke Foundation, and support from the “Fondation de l’Institut de Cardiologie de Montréal” to L.P.
Materials
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100-mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35-mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1X) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
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