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Biochemistry

एकल अणु से जानकारी संरचनात्मक झल्लाहट तेजी से नैनो पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग कर प्रयोगों

Published: February 9, 2017 doi: 10.3791/54782
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Biophysics, Ulm University
* These authors contributed equally

Introduction

एक बायोमोलिक्यूल की संरचना का निर्धारण अपने कार्य को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है। संरचना निर्धारण के लिए दो अच्छी तरह से स्थापित तरीकों क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 1, 2 हैं। आज, दोनों तरीकों Angstrom स्तर तक नीचे एक संकल्प के साथ उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। इन दो तरीकों जैसे प्रोटीन परिसरों के रूप में बड़े biomolecules की संरचना को स्पष्ट करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हालांकि मौजूदा तरीकों लगातार पिछले दशकों के दौरान सुधार किया गया है, जैविक संरचनाओं की जटिलता अभी भी संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक बड़ी चुनौती बन गया है, विशेष रूप से जब, बड़ी गतिशील और क्षणिक परिसरों 3 जांच कर रहे हैं।

macromolecular परिसर की गतिशीलता और विशेष रूप से संरचना समारोह संबंधों का अध्ययन करने के लिए, एकल अणु के तरीके नीति हैided उपयोगी जानकारी 4। कई नई रणनीति संरचनात्मक और गतिशील जानकारी प्राप्त करने पर एक orthogonal दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए विकसित किया गया। उदाहरण के लिए उच्च गति AFM 5, यांत्रिक हेरफेर 6, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण 7, साथ ही एकल अणु Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (smFRET) 8, 9 रहे हैं। काफी जल्दी झल्लाहट पर चूंकि Biomacromolecules 10 की लंबाई के पैमाने पर दूरी निर्भरता की वजह से एक आणविक शासक करार दिया गया है।

SmFRET से एक विशेष रूप से दिलचस्प आवेदन दूरी जानकारी smFRET माप से प्राप्त का उपयोग करने के लिए अनुमान है संरचनात्मक जानकारी 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23। smFRET के उच्च समय संकल्प के कारण, एक प्रोटीन संरचना के मोबाइल पार्ट्स की स्थिति अनुवादित किया जा सकता है। हालांकि, के लिए डाई अणु के बारे में smFRET डेटा महत्वपूर्ण सुधार मापदंडों से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए माप में 24 के दौरान निर्धारित किया जा करने की जरूरत है। इन सुधार कारकों के साथ, झल्लाहट दक्षता ई झल्लाहट सूत्र का उपयोग कर गणना की जा सकती

1 समीकरण ,


जहां मैं एक और मैं डी (चित्रा 2 देखें) कर रहे हैं। β-कारक स्वीकर्ता चैनल में पार बात के लिए खातों, दाता उत्सर्जन के रिसाव और से गणना की है

2 समीकरण

जहां मैं एक और मैं 'डी दाता की प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्वीकर्ता अणु की तस्वीर विरंजन के बाद स्वीकर्ता अणु हैं।

γ-कारक दो चैनलों में रिश्तेदार का पता लगाने क्षमता में अंतर के रूप में अच्छी तरह से दाता के प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज और स्वीकर्ता डाई में मतभेद सही। यह द्वारा हर व्यक्ति समय का पता लगाने से गणना की है

ध्यान दें, कि इस विवरण स्वीकर्ता अणु, जो कभी कभी महत्वपूर्ण हो जाता है और साथ ही साथ के लिए सही करने की आवश्यकता होगी के प्रत्यक्ष उत्तेजना neglects। इन सुधार कारकों का निर्धारण करने के लिए यह आदेश तस्वीर-शारीरिक परिवर्तन और संरचनात्मक गतिशीलता के बीच अंतर करने के लिए एक बारी में इस योजना के 25 में दोनों दाता के रूप में अच्छी तरह से स्वीकर्ता उत्तेजित करने के लिए उपयोगी है।

आदेश न केवल मात्रात्मक smFRET क्षमता है लेकिन यह भी मात्रात्मक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए, नैनो-पोजिशनिंग सिस्टम (एनपीएस) 2008 26 में शुरू किया गया था। नाम उपग्रह आधारित ग्लोबल पोजिशनिंग सिस्टम (जीपीएस) के लिए अपनी समानता के आधार पर चुना गया था। एनपीएस biomacromolecular परिसरों में अज्ञात डाई पदों के स्थानीयकरण के लिए smFRET और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी डेटा संयोजन एक संकर तकनीक है। गrystal संरचना एक संदर्भ फ्रेम के रूप में कार्य करता है और smFRET परिणाम एक अज्ञात fluorophore स्थिति (एंटीना) और एक स्थिति में क्रिस्टल संरचना (उपग्रह) से भी जाना जाता है के बीच की दूरी के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। लगातार प्रयोगों में एंटीना और कई उपग्रहों के बीच दूरी नापी जाती है और एंटीना की स्थिति एक सांख्यिकीय कठोर विश्लेषण Bayesian पैरामीटर आकलन के आधार पर इस योजना के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। नतीजतन, न केवल एंटीना की likeliest स्थिति गणना की जाती है, लेकिन इसकी पूर्ण 3 डी अनिश्चितता वितरण, तथाकथित पीछे, विश्वसनीय संस्करणों द्वारा कल्पना। इसके अलावा, एनपीएस पूरा smFRET नेटवर्क 27 के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए विस्तार किया गया था।

एनपीएस यूकेरियोटिक प्रतिलेखन में महत्वपूर्ण सवाल है, अर्थात् नदी के ऊपर डीएनए, गैर टेम्पलेट डीएनए और आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय बढ़ाव सह भीतर नवजात mRNA के पाठ्यक्रम की एक संख्या को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैmplex 12, 28, भी प्रतिलेखन दीक्षा के प्रभाव का प्रदर्शन 26 कारकों और एक खुले-प्रमोटर के गतिशील वास्तुकला जटिल 29। इसके अलावा, एनपीएस अर्चेअल शाही सेना पोलीमरेज़ खुले परिसर में 30 और प्रतिलेखन कारक दीक्षा TFE की स्थिति है, जो प्रतिलेखन कारक बढ़ाव Spt4 / 5 31 के रूप में ही साइट के लिए प्रतिस्पर्धात्मक रूप से बांधता है विशेष रूप से संरचना को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

तब से, smFRET आधारित संरचनात्मक दृष्टिकोण के एक नंबर 15, 18, 21, 23 प्रकाशित किया गया है। जब अलग smFRET आधारित संरचनात्मक तरीकों की तुलना, यह स्पष्ट हो जाता है कि विधि का स्पष्ट सटीक डाई मॉडल की खास पसंद पर निर्भर है। एक नोट करना चाहिए किडाई अणु अपने स्थानीय परिवेश के आधार पर अलग स्थानिक और orientational व्यवहार प्रदर्शन कर सकते हैं।

यह अंत करने के लिए, तेजी से एनपीएस 32 पेश किया गया था। फास्ट एनपीएस एक उन्नत नमूना एल्गोरिथ्म गणना बार काफी कम करने का उपयोग करता है। इसके अलावा, तेजी से एनपीएस एक एक संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए और प्रत्येक डाई अणु के लिए उपयोगकर्ता पाँच अलग अलग डाई मॉडल का एक सेट है, जो अगले वर्णित किया जाएगा से चुन सकते हैं अनुमति देता है। सबसे रूढ़िवादी मॉडल, क्लासिक कहा जाता है, यह मानता है कि डाई केवल एक ही है, लेकिन अज्ञात स्थान रखता है। इस स्थिति में, fluorophore एक शंकु, जिसका आकार अपने संबंधित (समय पर निर्भर) प्रतिदीप्ति anisotropy से निर्धारित किया जाता है के भीतर स्वतंत्र रूप से बारी बारी से कर सकते हैं। शंकु के उन्मुखीकरण ज्ञात नहीं है, जब दूरी में मापा जाता smFRET क्षमता परिवर्तित जो बड़े अनिश्चितताओं की ओर जाता है। इस संबंध में, मॉडल, रूढ़िवादी है, क्योंकि यह अन्य डाई मोड की तुलना में छोटी से छोटी सटीक करने के लिए नेतृत्व करेंगेरास। बहुत ही कम दूरी के लिए एक काफ़ी गलत स्थिति निर्धारण के लिए क्लासिक मॉडल नेतृत्व द्वारा किए गए मान्यताओं चाहिए। ठेठ smFRET मूल्यों के लिए, सही स्थिति हमेशा अपेक्षाकृत बड़े विश्वसनीय मात्रा में संलग्न है।

हालांकि, बाद में एक उच्च परिशुद्धता वांछनीय है, यह महत्वपूर्ण है को विकसित करने और वैकल्पिक डाई मॉडल है, जो परिशुद्धता में सुधार करने में मदद कर सकता है परीक्षण करने के लिए है। डाई अपने निहित प्रतिदीप्ति जीवनकाल की तुलना में ज्यादा तेजी से घूमता है, तो तथाकथित आईएसओ मॉडल लागू किया जा सकता है। इधर, उन्मुखीकरण कारक 2 κ (विशेषता isotropic फोर्स्टर त्रिज्या की गणना के लिए आवश्यक 1 समीकरण ) 2/3 के लिए निर्धारित है। नतीजतन, अभिकलन विश्वसनीय संस्करणों परिमाण छोटे के लगभग दो आदेशों क्लासिक मॉडल 32 में उन लोगों की तुलना में कर रहे हैं। मामला है कि fluorophore एक वातावरण में पाया जाता है कि न केवल तेजी से reori में सक्षम बनाता हैप्रलेखन, लेकिन इसके साथ ही तेज गति सभी अपने सुलभ मात्रा अधिक है, meanpos आईएसओ मॉडल का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस मॉडल में, डाई प्रभावी रूप से केवल एक ही मतलब स्थिति है, जहां स्थानिक औसतन एक बहुपद दूरी रूपांतरण 15 से हिसाब है रह रहे हैं। यह मॉडल लागू होता है अगर उदाहरण के लिए (आमतौर पर हाइड्रोफोबिक) डाई एक हाइड्रोफिलिक क्षेत्र, जैसे, डीएनए से जुड़ी है। Meanpos आईएसओ मॉडल के आवेदन लगभग दो का एक पहलू से विश्वसनीय वॉल्यूम के आकार में और कमी की ओर जाता है। हालांकि, एक डाई एक प्रोटीन से जुड़े अपने sterically सुलभ मात्रा (ए वी) में कई हाइड्रोफोबिक पैच के लिए reversibly बाँध सकता है। एक fluorophore कि तत्क्षण इन क्षेत्रों के बीच स्विच, लेकिन एक क्षेत्र के भीतर मुक्त रोटेशन से होकर गुजरती है और तेजी से स्थानीय गति सबसे अच्छा वर-meanpos आईएसओ मॉडल के आधार पर वर्णित है। एक ऐसी ही स्थिति में जो डाई वर-meanpos मॉडल लागू होता है बारी बारी से करने के लिए स्वतंत्र नहीं है। अधिक d इन मॉडलों के बारे में etails हमारे हाल ही में प्रकाशन के 32 में पाया जा सकता है।

इन मॉडलों को एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची विशेष रूप से विभिन्न वातावरण एक डाई मुठभेड़ हो सकता है के लिए खाते हैं और उन्हें लागू करने के बुद्धिमानी से अपनी स्थानीयकरण परिशुद्धता का अनुकूलन कर सकते हैं। फास्ट एनपीएस में हर डाई एक विशिष्ट स्थिति से जुड़ी अणु एक व्यक्ति के मॉडल को सौंपा जा सकता है, जैसे कि झल्लाहट भागीदारों के अलग अलग मॉडल है की अनुमति है। इस असीम और बंद करने वाली प्रकृति मॉडलिंग सक्षम बनाता है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि एक कठोर सांख्यिकीय परीक्षण करता है सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम अंतिम मॉडल संयोजन के द्वारा प्राप्त की प्रयोगात्मक डेटा के साथ समझौते में अब भी है। इन परीक्षणों फास्ट एनपीएस सॉफ्टवेयर में शामिल किए गए हैं।

आदेश में प्रयोगात्मक डेटा को तेजी से लागू करने के लिए एनपीएस में (केवल) तीन इनपुट पैरामीटर्स की माप की आवश्यकता है। सबसे पहले, डाई-जोड़ी विशिष्ट isotropic फोर्स्टर त्रिज्या (/54782/54782eq5.jpg "। इसलिए, दाता डाई की मात्रा उपज (QY) />) निर्धारित किया जाना है, दाता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा मापा जा करने की जरूरत है। इन मापों में किया जा सकता है थोक, एक मानक स्पेक्ट्रोमीटर और एक मानक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर। प्रत्येक जोड़ी के लिए, आर 0 तब फ्रीवेयर PhotochemCAD उपयोग कर की गणना की जाती है और एनपीएस विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, (समय हल) डाई अणु के प्रतिदीप्ति anisotropies जरूरत एक ध्रुवीकरण (और समय) संवेदनशील प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर प्राप्त किया जाना है। हालांकि, तेजी से एनपीएस के लिए सबसे महत्वपूर्ण इनपुट पैरामीटर smFRET इस तरह के एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM) के रूप में एक एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेटअप पर मापा क्षमता, कर रहे हैं ।

यहाँ, हम smFRET डेटा प्राप्त करने और तेजी से एनपीएस (चित्रा 1) को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Protocol

1. किसी और चीज की और लैब उपकरण

नोट: माप चैम्बर के विधानसभा में 3 चित्र में दिखाया गया है। एक क्वार्ट्ज ग्लास (जुड़े सिलिका) स्लाइड, एक सील फिल्म और एक coverslip कि प्रवाह कक्ष जवानों: माप चैम्बर के सैंडविच डिजाइन के तीन प्रमुख घटक शामिल हैं। माप चैम्बर एक स्वनिर्धारित नमूना धारक पर मुहिम शुरू की है। नमूना कक्ष और धातु धारक के आयामों के एक मानक माइक्रोस्कोपी क्वार्ट्ज गिलास स्लाइड (76 मिमी x 26 मिमी) को फिट करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

  1. कट क्वार्ट्ज चित्रा 4 में संकेत पदों पर एक हीरे की ड्रिल (0.75 मिमी) का उपयोग कर गिलास स्लाइड। क्वार्ट्ज गिलास स्लाइड के डिजाइन के क्रम में प्रत्येक स्लाइड के दो पक्षों के बीच अंतर करने में विषम है।
    नोट: क्वार्ट्ज स्लाइड माप के बाद फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक सतह खरोंच हो जाता है।
  2. कक्षों माउंट करने के लिए, अनुकूलित धातु नमूना धारकों उपयोग के रूप में चित्रा 5 <में चित्रित/ Strong>। नमूना धारकों के क्रम में एक इनलेट और प्रवाह कक्ष के लिए एक दुकान ट्यूबिंग कनेक्ट करने में दो धागे (एम 4) होते हैं। इसके अलावा, धातु धारक के रूप में अच्छी तरह से धागे (एम 3) पर नमूना कक्ष माउंट करने के धागे (एम 3) का उपयोग धातु धारक के निचले आधे करने पर चश्मे धारक को ठीक करने के लिए।
  3. एक चश्मे प्रकार कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (TIRFM) (चित्रा 6) पर smFRET मापन प्रदर्शन।
    नोट: दाता की उत्तेजना और स्वीकर्ता डाई अणु के साथ-साथ एक नीले रंग की लेजर (491 एनएम के लिए और एक लाल लेजर (643 एनएम, डायोड लेजर): एक हरे (YAG लेजर 532 एनएम, एन डी:) TIRFM तीन लेज़रों सुविधाएँ , डायोड पंप ठोस राज्य लेजर) नमूना कक्ष smFRET माप से पहले पृष्ठभूमि पर फ्लोरोसेंट दोष विरंजन के लिए। तीन लेजर बीम स्थानिक संयुक्त रहे हैं और एक acousto ऑप्टिक tunable फिल्टर (AOTF) के माध्यम से चुना जा सकता है। प्रतिदीप्ति प्रकाश एक उच्च एपर्चर उद्देश्य से एकत्र किया जाता है, एक दाता में विभाजित है और एक को स्वीकारया दो ईएम सीसीडी कैमरों पर एक dichroic दर्पण और अनुमानित उपयोग करके चैनल। नमूना कक्ष एक माइक्रोमीटर दो चरण stepper मोटर्स के साथ एक्स और वाई-दिशा में आंदोलन की इजाजत देने से जुड़ा हुआ है। एक तीसरा पीजो मोटर प्रयोग के दौरान इष्टतम फोकस सुनिश्चित करने के लिए एक ऑटो फोकस प्रणाली का निर्माण करने के लिए एक आईआर लेजर और एक स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जाता है।
    1. बारी लेजर उत्तेजना (एलेक्स) जब झल्लाहट समय प्रक्षेप पथ में गतिशीलता 25 मनाया जाता है का प्रयोग करें। इस तरह की गतिशीलता के अणुओं के भीतर या तो गठनात्मक परिवर्तन से या स्वीकर्ता चमक और स्वीकर्ता निमिष में उतार-चढ़ाव की वजह से हो सकता है।
      नोट: एलेक्स इन दो संभावित कारणों के बीच भेदभाव के लिए अनुमति देता है और गतिशील झल्लाहट प्रक्षेप पथ की गलत व्याख्या से बचाता है। हालांकि, सादगी के कारणों के लिए, प्रोटोकॉल हिस्सा एलेक्स के बिना लिया फिल्मों के विश्लेषण के लिए प्रतिबंधित है।
      सावधानी: कक्षा 3 बी लेज़रों एकल अणु प्रतिदीप्ति सेटअप में इस्तेमाल कर रहे हैं। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त लासेवा सुरक्षा सावधानियों, स्थानीय सरकार के नियमों के अनुसार, इससे पहले कि सिस्टम चलाया जा रहा है ले लिया गया है।
  4. अवशोषण एक यूवी तुलना स्पेक्ट्रोमीटर पर क्वांटम उपज का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया माप प्रदर्शन (सामग्री और तरीके देखें)।
  5. (सामग्री और तरीके देखें) दाता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम, स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रम और एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर पर प्रतिदीप्ति anisotropy की माप प्रदर्शन करना।
  6. प्रकाशित प्रक्रियाओं 33 के अनुसार नमूना कक्षों तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया में [34] इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन किया।
  7. smFRET के लिए एक दाता स्वीकर्ता डाई अणु जोड़ी अनुकूल के साथ जांच के नमूने लेबल और यह सुनिश्चित नमूना कक्ष की सतह पर स्थिरीकरण के लिए एक बायोटिन आधा भाग नहीं है।
    नोट: आदेश में तेजी से एनपीएस सॉफ्टवेयर अलग नमूना निर्माणों की जरूरत है के साथ एक अज्ञात एंटीना डाई स्थिति स्थानीयकरण करने में। हर निर्माण needs अज्ञात एंटीना डाई स्थिति पर एक लेबल और एक उपग्रह क्रिस्टल संरचना से जाना जाता स्थिति पर एक लेबल है। एंटीना स्थिति से जुड़ी रंगों और तीन अलग अलग उपग्रह पदों के साथ कम से कम तीन अलग अलग निर्माणों सटीक परिणाम के लिए आवश्यक हैं। एंटेना के बीच के साथ ही उपग्रहों के बीच माप भी सटीकता में सुधार करने के लिए उपयोगी होते हैं, हालांकि, इस डाई अणु जो सही ढंग से विश्लेषण में दर्ज किए जाने की जरूरत के आदान-प्रदान की आवश्यकता है।

एक कस्टम धारक में प्रवाह कक्षों की 2. बढ़ते

  1. सिलिकॉन टयूबिंग (0.8 मिमी आईडी, 2.4 मिमी आयुध डिपो) खोखला टैब शिकंजा (एम 4) में खींच और दोनों सीधे एक तेज धार का उपयोग द्वारा दोनों पक्षों पर 1 सेमी की एक की अधिकता छोड़ने सिरों पर ट्यूबिंग काटा। टैब पेंच के एक तरफ के बारे में 2 मिमी के लिए ट्यूबिंग की अधिकता को समायोजित करें।
  2. एक तरीका है कि क्वार्ट्ज गिलास स्लाइड में छेद नमूना धारक में धागे से मेल में नमूना धारक में प्रवाह कक्ष माउंट। कसोइनलेट और आउटलेट शिकंजा धीरे सुनिश्चित करने के लिए कि इनलेट और नमूना कक्ष की दुकान अभी भी दिखाऊ हैं। धीरे एक्रिलिक गिलास धारक के चार शिकंजा कसने के प्रवाह कक्ष की स्थिति को ठीक करने के लिए।
  3. कट सिलिकॉन टयूबिंग (0.58 मिमी आईडी, 0.96 मिमी आयुध डिपो), 20 सेमी लंबे टुकड़ों में। इनलेट और माप चैम्बर के आउटलेट पेंच को टुकड़ों में से एक डालें। एक क्लैंप का उपयोग करके इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग बंद करें।
    ध्यान दें: इकट्ठे नमूना कक्षों अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।

3. TIRF माइक्रोस्कोप पर smFRET मापन

  1. पीबीएस के 500 μL के साथ नमूना कक्ष धोने के लिए एक सिरिंज का प्रयोग करें। एक अलग बफर समाधान को बदलने से पहले इनलेट ट्यूबिंग के अंत में एक छोटी बूंद बनाने के द्वारा हर समय नमूना कक्ष में प्रवेश करने से हवा के बुलबुले रोकें।
  2. 100 μL neutravidin (0.5 मिलीग्राम / पीबीएस में एमएल) समाधान के साथ नमूना कक्ष फ्लश और कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं।
  3. धुलाईबाहर पीबीएस के 500 μL के साथ neutravidin समाधान।
  4. नमूना कक्ष पर चश्मे के लिए धातु धारक भाड़ में।
  5. TIRF माइक्रोस्कोप की माइक्रोमीटर चरण के लिए नमूना कक्ष माउंट। उद्देश्य के सामने क्षैतिज रूप में सीधे रूप में संभव नमूना कक्ष माउंट करने के लिए प्रक्रिया स्कैनिंग के दौरान defocusing से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. सॉफ्टवेयर ईएम सीसीडी कैमरों और मंच के पीजो मोटर्स को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने शुरू करो।
  7. आईआर लेजर का प्रतिबिंब को देखकर खुर्दबीन उद्देश्य का ध्यान केंद्रित को समायोजित करें।
  8. धातु चश्मे धारक के शीर्ष पर चश्मे (PS991, एन = 1.52) रखें। सुनिश्चित करें कि लेजर बीम मारा चश्मे तो एक चिपकने का उपयोग करें और 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ सेते बनाने के लिए चश्मे के पार्श्व स्थिति को समायोजित करें।
    ध्यान दें: चढ़कर चश्मे सफाई से पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  9. कैमरा नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें "सेटअप अधिग्रहण" में और निम्न अधिग्रहण पैरामीटर परिभाषित: 100 एमएस एकीकृतआयन समय, 401 फ्रेम / फिल्म (हरी कैमरा), 400 फ्रेम / फिल्म (लाल कैमरा), इलेक्ट्रॉन गुणक 14 बिट पर 225, पूर्व एम्पलीफायर लाभ 5x और readout दर 3 मेगाहर्ट्ज हासिल है।
  10. माप के लिए स्थानीय हार्ड ड्राइव पर एक फ़ोल्डर बनाएँ। एक वांछित नाम माप फ़ाइलों के लिए, उदाहरण के लिए साल के महीने के दिन चुनें। सॉफ्टवेयर सेटिंग्स "ऑटो को बचाने के" सवार करने के लिए जाने में सक्षम "ऑटो बचाने के लिए" और फ़ाइल स्वरूप का चयन * फिल्म अधिग्रहण के लिए .sif। हार्ड डिस्क पर फ़ोल्डर का चयन करें। filestem के रूप में फ़ोल्डर नाम का प्रयोग करें।
  11. "AutoIncrement" समारोह (1 पर सेट प्रारंभ मान) को सक्रिय करें। फ़ाइल नाम के लिए एक ऑपरेटर की कुर्की सक्षम करें। दाता और स्वीकर्ता चैनल के लिए "डॉन" और "एसीसी" का प्रयोग क्रमशः। चुनें "_" विभाजक के रूप में।
  12. पर "वीडियो" कैमरा नियंत्रण सॉफ्टवेयर क्लिक करें नमूना कक्ष स्कैनिंग सभी तीन लेज़रों की अधिकतम लेजर तीव्रता (का उपयोग करके कॉम कैमरा और ब्लीच पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का जीना छवि शुरू करने के लिएbined ≈3,000 डब्ल्यू / 2 सेमी 10 के लिए देखने के क्षेत्र प्रति s)।
  13. नीले लेजर बंद कर दें। लाल लेजर के लिए चारों ओर 200 W / 2 सेमी और लगभग 40 मेगावाट / 2 सेमी करने के लिए हरे रंग की लेजर की तीव्रता कम है, तो बारी लेजर उत्तेजना (एलेक्स) का इस्तेमाल किया जाता है।
  14. 50-100 बजे के एक एकाग्रता के लिए biotinylated फ्लोरोसेंट नमूना पतला। समाधान का लोड 100 μL। नमूना बाध्यकारी पर चैम्बर सतह पर स्थिर है।
    नोट: चैंबर अधिभार के लिए नहीं सुनिश्चित करें। पड़ोसी अणुओं को एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए।
  15. यदि आवश्यक हो, चैम्बर के लिए एक 2x अधिक ध्यान केंद्रित नमूने की एक अतिरिक्त 100 μL लोड।
  16. माप चैम्बर clamps का उपयोग कर लोड हो रहा है पूरा हो गया है के बाद से इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग सील।
  17. सभी लेज़रों बंद कर और प्रवाह कक्ष को देखने के दो क्षेत्रों को स्थानांतरित करने के लिए आगे पीजो मोटर्स का उपयोग करें।
  18. कैमरा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पर "लो संकेत" पर क्लिक करें फिल्म रिकॉर्डिंग और स्विच शुरू करने के लिएएक ही समय में लेजर पर। सुनिश्चित करें कि अणुओं के 80% से अधिक लेजर शक्ति का समायोजन करके फिल्म के अंत तक प्रक्षालित कर रहे हैं।
  19. दोहराएँ 3.17 और 3.18 पूरे prebleached नमूना कक्ष क्षेत्र के लिए कदम।

4. परिवर्तन मानचित्र का अधिग्रहण ( "beadmap")

  1. धारा 1.1, 1.2 और 2 में वर्णित के रूप में एक प्रवाह कक्ष तैयार करें।
  2. avidin लेपित फ्लोरोसेंट multispectral मोती जो दाता में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन और स्वीकर्ता चैनल दिखाने का प्रयोग करें। भंवर 1 मिनट के लिए शेयर, तो शेयर के 50 μL 50 μL DDH 2 ओ भंवर में फिर से 1 मिनट के लिए पतला, sonicate 1-2 मिनट, फिर एक और 10 S भंवर।
  3. बाहर smFRET माप (धारा 3.5-3.10) के लिए वर्णित कदम ले।
  4. प्रवाह के चेंबर में 2 पतला फ्लोरोसेंट मोती: 1 का लोड 100 μL (1 चैम्बर मात्रा)। फ्लोरोसेंट मोती सतह के लिए बाध्य करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  5. 3.9 लेकिन चान में अधिग्रहण पैरामीटर का प्रयोग करें26 जीई फिल्म की लंबाई (हरी कैमरा) और 25 (लाल कैमरा) और 10 से इलेक्ट्रॉन गुणक लाभ।
  6. 20 डब्ल्यू / 2 सेमी के एक मूल्य के लिए हरे रंग की लेजर की तीव्रता सेट करें।
  7. लगभग 50-100 मोतियों के साथ देखने का एक क्षेत्र में एक फिल्म के लिए ले लो।

5. प्रसंस्करण और smFRET डेटा का विश्लेषण

  1. beadmap के विश्लेषण के लिए कस्टम लिखा सॉफ्टवेयर एसएम झल्लाहट का प्रयोग करें और अधिग्रहण फिल्में (सामग्री और तरीके देखें)। कार्यक्रम viewPlot1.m शुरू करो।
  2. विश्लेषण पर क्लिक करें | बैच विश्लेषण, विकल्प "एलेक्स" अचयनित अगर यह प्रयोग नहीं किया गया है। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए पीक निष्कर्ष "उच्च" के लिए सीमा चुनें। दबाबो ठीक"।
  3. "नहीं" चुनें जब उनसे पूछा गया कि एक beadmap पहले से विश्लेषण किया गया है। का अधिग्रहण beadmap वाले फ़ोल्डर को ब्राउज़ और (उस पर डबल क्लिक करके) * .sif फ़ाइल का चयन करें। अगले संवाद खिड़की प्रेस में "ठीक है"।
    नोट: एक beadmap पहले से ही पिछले एक उपाय में विश्लेषण किया गया है तोजाहिर है, "हाँ" यहाँ का चयन और beadmap * .map फाइल पर सही फ़ोल्डर और डबल क्लिक करने के लिए ब्राउज़ द्वारा बचाया beadmap का चयन करें। कदम 5.8 के साथ जारी रखें।
  4. दो एकल देखने के क्षेत्र के विपरीत कोनों में तैनात मोती चुनें। पिक्सेल तीव्रता कलर-कोडेड गहरे नीले (कम तीव्रता) से गहरे लाल (उच्च तीव्रता) कर रहे हैं।
  5. पहले मनका के केंद्र पर क्लिक करें। अणु के केंद्र रंग-कोडिंग के द्वारा स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है, तो चुनें "हाँ" या किसी और "नहीं" क्लिक करें और एक अलग अणु जोड़ी का चयन।
  6. अधिकतम तीव्रता और प्रेस "रखना" दिखा पिक्सेल पर crosshair स्थिति। दूसरे चैनल के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  7. विपरीत कोने में अणु पर क्लिक करें और दोहराने 5.5 और 5.6 कदम।
    नोट: दो चैनलों के रिश्तेदार पिक्सेल पारी कमांड विंडो में प्रदर्शित किया जाता है और परिवर्तन के नक्शे के रूप में स्वचालित रूप से beadmap * युक्त फ़ाइल .sif फ़ोल्डर में * .map फ़ाइल को बचाया है <।/ Li>
  8. "बैच विश्लेषण के लिए" दाता और स्वीकर्ता फिल्में (* .sif) लोड करने के लिए, फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़, सभी फिल्मों है कि विश्लेषण किया जाएगा का चयन करें और "ठीक" पर क्लिक करें। अगले संवाद विंडो में प्रेस "ठीक है"।
    नोट: बैच विश्लेषण समाप्त हो गया है जब पिछले लेन कमांड विंडो में प्रदर्शित साथ शुरू होता है "समाप्त विश्लेषण ..."। पता चला अणुओं को एक नई विंडो, जो भी दाता के रिश्तेदार पारी और स्वीकर्ता चैनल परिवर्तन के नक्शे से चुना गया इंगित करता है में प्रदर्शित कर रहे हैं।
  9. लोड करने के लिए batched फिल्म फाइल पर क्लिक करें | लोड। विकल्प "एलेक्स" अगर यह प्रयोग नहीं किया गया है अनचेक करें। 10 smoothwidth निर्धारित करें और क्लिक करें "ठीक है"। * .ttr फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर चुनें और अगले संदर्भ मेनू में "सभी का चयन करें" और "ठीक" पर क्लिक करें।
  10. प्रदर्शित किया ट्रेस विशेषता smFRET चरणों (चित्रा 2) टॉगल बटन पर प्रेस की सुविधा है, तो "चयनित नहीं" और पहलेमाउस कर्सर के साथ चलती लाइन और बाईं माउस बटन पर क्लिक करके झल्लाहट घटना की शुरुआत के समय बिंदु का चयन करें। अगली स्वीकर्ता अणु की ब्लीचिंग और दाता अणु के विरंजन के अंत में समय बिंदु के समय बिंदु का चयन करें।
  11. अगली विंडो में झल्लाहट दक्षता नीले रंग में साजिश रची है। ट्रेस प्रेस का चयन करने के लिए "हाँ" बटन अन्यथा चुनें "नहीं"। करने के लिए फिर से पहुँचने के लिए एक समय का पता लगाने क्लिक करें "पिछला" बटन।
  12. फिल्म के अंतिम अणु जब तक प्रक्रिया को दोहराएँ।
  13. "| बचाना फाइल" एक फिल्म में आखिरी अणु विश्लेषण करने के बाद पर क्लिक करके चयन निशान बचाने के लिए। * .sif फ़ाइलों के रूप में एक ही फ़ोल्डर में चयन निशान बचाओ।
  14. दोहराएँ सब हासिल कर लिया फिल्मों के लिए 5.10-5.13 कदम।
  15. कार्यक्रम combine_fret_results.m निष्पादित। * .res फ़ाइलें और सभी * .FRETonly_trace फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें। MW.dat के रूप में अणु-वार झल्लाहट और फ्रेम के लिहाज से झल्लाहट फाइलों को बचाने औरFRW.dat, क्रमशः।
    नोट: * .dat फ़ाइलें ASCII फ़ाइलों के रूप में सहेज कर रहे हैं। FRW.dat फ़ाइल छह कॉलम और प्रत्येक झल्लाहट फ्रेम के लिए एक पंक्ति होती है। छठे स्तंभ को सही फ्रेम वार झल्लाहट दक्षता में शामिल है। MW.dat फ़ाइल 21 कॉलम और चयनित झल्लाहट अणु प्रति एक पंक्ति होती है। तीसरे स्तंभ अणु-वार झल्लाहट दक्षता में शामिल है।

6. histograms में smFRET डेटा प्रदर्शित

नोट: आदेश में सभी रिकॉर्ड smFRET डेटा फ्रेम वार डेटा या अणु के लिहाज से डेटा histograms में साजिश रची और गाऊसी (एकाधिक) चोटियों के लिए फिट बैठता उपयोग विश्लेषण कर रहे smFRET का मतलब दक्षता निकालने के लिए। बाद में, प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है (देखें सामग्री सूची)। हालांकि, किसी भी अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर बजाय प्रयोग किया जा सकता है।

  1. एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें (देखें सामग्री सूची)। आयात | | कई आस्की फाइल पर क्लिक करें। FRW.dat फ़ाइल वाले फ़ोल्डर का चयन करें। फ़ाइल का चयन करें और प्रेस "ठीक & #34 ;. एक बदलाव के बिना "ठीक है" के साथ इनपुट विकल्प स्वीकार करते हैं।
  2. सांख्यिकी | | हिस्टोग्राम तीसरे स्तंभ सी (वाई) को सही झल्लाहट क्षमता युक्त का चयन करें, स्तंभ और प्लॉट का चयन पर राइट क्लिक करें। हिस्टोग्राम विंडो में स्तंभों पर डबल क्लिक करें और अचयनित "स्वत: binning" और एक वांछित बिन-आकार, जैसे, 0.05 का चयन करें। इसके अलावा शुरुआत और अंत मूल्यों, -0.025 और 1.025 चुनें जैसे।
  3. उन पर छोड़ दिया क्लिक करके हिस्टोग्राम के स्तंभों का चयन करें। फिर राइट क्लिक करें और "बिन वर्कशीट के लिए जाना" चुनें। उस पर छोड़ दिया क्लिक करके "मायने रखता है" स्तंभ का चयन करें और फिर ठीक क्लिक करें और चुनें प्लॉट | कॉलम / बार / पाई | कॉलम।
  4. फिटिंग | | Nonlinear वक्र फिट | खोलें संवाद स्तंभ बार साजिश में विश्लेषण के लिए जाना। समारोह के तहत "गाऊसी" चुनें तो "पैरामीटर" सवार के पास जाओ। अचयनित करें ऑटो पैरामीटर आरंभीकरण। 'फिट' पर ऑफसेट मूल्य (y0) 0. क्लिक करें ठीक करें।
    नोट: फिट समारोह के रूप में अच्छी तरह से ढाले deपूंछ अब स्तंभ साजिश में प्रदर्शित कर रहे हैं। "XC" मूल्य फिट समारोह, यानी, मतलब झल्लाहट दक्षता कि एनपीएस सॉफ्टवेयर के लिए इनपुट पैरामीटर के रूप में कार्य करता है के केंद्र देता है।

क्वांटम उपज की 7. मापन

  1. प्रक्रिया Würth एट अल द्वारा वर्णित के समान रिश्तेदार विधि के साथ क्वांटम उपज दृढ़ संकल्प को पूरा करें। 35, Rhodamine का उपयोग कर 101 इथेनॉल (QY = 91.5%) एक मानक के रूप में भंग कर दिया।
  2. एक यूवी तुलना स्पेक्ट्रोमीटर 1 सेमी पथ लंबाई की एक अवशोषण क्युवेट में एक 80 μL मात्रा का उपयोग करने पर रिकार्ड अवशोषण स्पेक्ट्रा। तरंग दैर्ध्य में absorbance जो प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा 0.05 ≤ किया जाना है।
  3. एक दीपक से calibrated स्पेक्ट्रोमीटर फोटॉन गिनती मोड में संचालित पर रिकार्ड उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। एक Spectr का उपयोग कर उत्तेजना (0 डिग्री) और उत्सर्जन (54.7 डिग्री) पथ (जादू कोण की स्थिति) में Glan थॉम्पसन polarizers के साथ मापन प्रदर्शन के बारे में 5 एनएम और उत्तेजना और उत्सर्जन monochromator के लिए 2.5 एनएम, क्रमशः के अल बैंडविड्थ। उपाय के नमूने उन्हें 3 मिमी पथ की लंबाई ख्याल रखने के साथ एक प्रतिदीप्ति क्युवेट कि गिनती दर 10 6 एस -1 से अधिक नहीं है के लिए स्थानांतरित करने के बाद।
    1. के अनुसार क्वांटम उपज की गणना

समीकरण 6

जहां n और एसटीडी नमूना और मानक क्रमश: विलायक के अपवर्तक सूचकांक हैं। एफ (λ) और f_Std (λ) नमूने के प्रतिदीप्ति तीव्रता और तरंग दैर्ध्य λ पर मानक हैं। एक (λ पूर्व) और एक एसटीडी (λ पूर्व) उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में नमूना और संदर्भ के absorbance कर रहे हैं और Φ एसटीडी मानक की मात्रा उपज है।

Le "> 8। Isotropic फोर्स्टर त्रिज्या की गणना

  1. isotropic फोर्स्टर त्रिज्या की गणना ( 5 समीकरण ) दाता अणु के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से, स्वीकर्ता अणु के अवशोषण स्पेक्ट्रम, दाता की मात्रा उपज और माध्यम के अपवर्तनांक। की गणना के लिए फ्रीवेयर PhotochemCAD का प्रयोग करें 1 समीकरण । हालांकि किसी भी अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर के बजाय 36 का इस्तेमाल किया जा सकता है।

9. Anisotropies का मापन

  1. विभिन्न उत्तेजना / उत्सर्जन polarizer सेटिंग्स (वी / वी, वी / एच, एच / वी, एच / एच), 36 के साथ प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग से स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति anisotropies निर्धारित करते हैं।
  2. जी कारक है, जो साधन के ध्रुवीकरण कलाकृतियों के लिए सही गणना, से प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिएअनुपात

समीकरण 9

और प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए anisotropy मूल्य की गणना करने के लिए इसे उपयोग करें:

समीकरण 10

जहां मैं xy के लिए उत्तेजना ध्रुवीकरण एक्स और उत्सर्जन ध्रुवीकरण Y तीव्रता इंगित करता है।

  1. उत्सर्जन वर्णक्रमीय रेंज भर में मूल्यों औसत स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति anisotropy गणना करने के लिए।

10 फास्ट एनपीएस सॉफ्टवेयर की स्थापना

  1. http://www.cgl.ucsf.edu/chimera से डाउनलोड करें UCSF कल्पना और अधिष्ठापन गाइड का पालन करें।
  2. "बायोफिज़िक्स के संस्थान 'की वेबसाइट पर जाएंhttps://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html: उल्म विश्वविद्यालय में। फास्ट एनपीएस के वर्तमान संस्करण डाउनलोड करें और अपनी पसंद की एक फ़ोल्डर में निकाल सकते हैं। सबफ़ोल्डर खोलें "पुनर्वितरण" और दृश्य C ++ Redistributable जो सिस्टम के लिए उपयुक्त है स्थापित करें।

11. PDB फ़ाइल एकत्रित

  1. कल्पना में ब्याज की PDB फ़ाइल (s) खोलें। macromolecular परिसर के सभी परमाणुओं का चयन करें और केन्द्रक के निर्देशांक की गणना (उपकरण | संरचना विश्लेषण | कुल्हाड़ियों / विमान / centroids | परिभाषित केन्द्रक ... | ठीक)।
  2. ओपन उत्तर लॉग (पसंदीदा | लॉग उत्तर) और परिवर्तन उपकरण (उपकरण | आंदोलन | निर्देशांक रूपांतरण)। केन्द्रक उत्तर लॉग निर्देशांक रूपांतरण विंडो के पाठ बॉक्स "बदलाव" में में दिखाया गया के निर्देशांक दर्ज करें और हर समन्वय स्थापित की निशानी बदल जाते हैं। प्रेस "लागू करें" और "पी डी बी सहेजें" (फ़ाइल | बचाना पीडीबी) के साथ फ़ाइल सहेजें।

12. सेटिंगस्थिति Priors

नोट: सभी मूल्यों angstrom में माना जाता है।

  1. तकनीकी कंप्यूटिंग भाषा आरंभ और स्थानीय फास्ट-एनपीएस फ़ोल्डर में वर्तमान फ़ोल्डर बदल जाते हैं। कमांड विंडो में दर्ज करें: FastNPS।
  2. परियोजना प्रबंधक (| नई परियोजना) में एक नया jobfile बनाएँ।
  3. (| मॉडल डाई से पहले उपकरण) की स्थिति से पहले सेट करें।
  4. पैनल "से पहले मूल बातें" में इसकी कीमत में प्रवेश करने से पहले की स्थिति के स्थानिक संकल्प को परिभाषित (2 सिफारिश की है)।
  5. चेक बॉक्स को सक्रिय करने और "लोड PDB" बटन पर क्लिक करके macromolecule के इंटीरियर को बाहर निकालें। का चयन करें और धारा 11 में वर्णित के रूप में केंद्रित PDB फ़ाइल लोड।
  6. अनुमानित व्यास निर्दिष्ट करें (13 एक की सिफारिश की है, चर्चा देखें) डाई के अपने मूल्य दर्ज करके।
  7. एक skeletonization दूरी, यानी, दूरी डाई अणु macromolecule में घुसना सकता है डालें (2 एक सिफारिश की है)।
  8. मेंपैनल "अधिकतम आकार से पहले" की स्थिति से पहले कम से कम और अधिक से अधिक निर्देशांक दर्ज (अनुशंसित: [-150150] में एक्स में [-150150] y और z में [-150150])।
  9. जब एक उपग्रह को परिभाषित करने, पैनल "से पहले मूल बातें" में चेकबॉक्स "लचीला लिंकर के माध्यम से लगाव" को सक्रिय करने और पैनल "लिंकर" परमाणु के निर्देशांक (केंद्रित PDB फ़ाइल में), जिस पर डाई अणु जुड़ा हुआ है में दर्ज करें। इसके अलावा, उनके मूल्यों दर्ज करके लंबाई और लिंकर के व्यास निर्दिष्ट (13 ए और 4.5 की सिफारिश की है, चर्चा देखें)। एक एंटीना के मामले में इस बिंदु को छोड़।
  10. "सुलभ मात्रा की गणना" बटन दबाएँ।
  11. स्थिति से पहले बचाने के लिए और वैकल्पिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दृश्य प्रयोजनों ऐसी कल्पना के रूप में के लिए निर्यात।

13. नेटवर्क ज्यामिति की परिभाषा

  1. परिभाषित माप खिड़की (| संपादित ज्यामिति मोड) खोलें।
  2. बट का उपयोग करके एक नया डाई अणु बनाएं"नई" पैनल "रंजक" में पर।
  3. एक मान दर्ज करके इसकी प्रतिदीप्ति anisotropy (धारा 9) सेट और लटकती मेनू "डाई मॉडल" के भीतर एक डाई मॉडल का चयन करें।
  4. , बटन "लोड" प्रेस से पहले इसी स्थिति का चयन करें और डाई की सक्रिय चेक बॉक्स की जाँच करें। सभी एंटेना के लिए और साथ ही सभी उपग्रहों के लिए सभी रंगों, IE के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  5. सभी रंगों बनाने के बाद, माप को परिभाषित। क्लिक "नया" पैनल "माप" में से एक नई माप बनाएँ।
  6. लटकती मेनू "Dye1" और नीचे "Dye2" में अपनी झल्लाहट के भागीदारों का चयन करें।
  7. त्रुटि के साथ smFRET दक्षता और इस डाई जोड़ी के isotropic फोर्स्टर त्रिज्या दर्ज करें।
  8. अंत में, माप की सक्रिय चेक बॉक्स की जाँच करें। सभी मापन के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: बार बार नेटवर्क है, तेजी से जटिल हो जाता है तो यह है कि उपयोगकर्ता उलझन में मिल सकता है। आदेश preven करने के लिएगलतियों के लिए टी, "चेक नेटवर्क" बटन दबाने से नेत्रहीन नेटवर्क की जाँच करें। चित्रा सक्रिय रंगों को प्रदर्शित करता है और झल्लाहट रंगों परस्पर लाइनों के माध्यम से माप इंगित करता है।

14. गणना

  1. (| गणना मोड) गणना विंडो खोलें।
  2. नेटवर्क में हर डाई एक विशेष मॉडल सौंपा गया है, तो "यूजर परिभाषित" और "गणना" दबाने से गणना शुरू करते हैं। एक ही मॉडल में सभी रंगों करवाने के लिए, पांच मॉडल (क्लासिक, आईएसओ, meanpos-आईएसओ, वर-meanpos-आईएसओ और वर-meanpos) में से एक का चयन करें और जारी रखें।
    ध्यान दें: कमांड विंडो गणना की प्रगति का संकेत होगा। जब गणना पूरी हो चुकी है फास्ट एनपीएस एक पॉप-अप संदेश के साथ ऐसा करेंगे।

परिणाम 15 दृश्य

  1. (| देखें परिणाम मॉडल) आदेश, रंगों के विश्वसनीय मात्रा में निर्यात देखें परिणाम विंडो खोलने के लिए है।
  2. निर्यात डाई घनत्व:
    1. निर्यातअकेले या एक साथ सभी रंजक। आदेश में एक एकल डाई पैनल "प्रदर्शित रंजक" और प्रेस "निर्यात घनत्व" में चयन का निर्यात करने में। एक संकल्प दर्ज (2 सिफारिश की है) और निर्यात के लिए एक फ़ाइल प्रकार का चयन करें। सही पर घनत्व पूर्वावलोकन किया है और इसकी विशेषताओं में से कुछ गणितीय दिखाए जाते हैं।
    2. आदेश में निर्यात करने के लिए सभी रंगों को एक साथ धक्का "बैच निर्यात" में।
  3. कल्पना में जिसके परिणामस्वरूप घनत्व फ़ाइलें खोलें।

चुना मॉडल संयोजन 16. निरंतरता की जाँच

  1. (| देखें परिणाम मॉडल) देखें परिणाम विंडो खोलें। पैनल "गणना जानकारी" पाठ बॉक्स "स्थिरता" में एक मूल्य से कम 90% को प्रदर्शित करता है, तो मौजूदा मॉडल मापा smFRET क्षमता पर्याप्त प्रतिनिधित्व नहीं करता है और इस तरह असंगत है।
  2. विसंगति के मामले में बटन "विस्तृत स्थिरता" धक्का। माप 90% से नीचे एक मूल्य है कि के लिए खोजें। अगर एक या ज्यादा डाईएस मुख्य रूप से इन मापों में शामिल कर रहे हैं, उनके मॉडल विसंगति पैदा होने की संभावना हैं। इन रंगों के लिए विभिन्न मॉडलों पर विचार डाई और तेजी से एनपीएस गणना फिर से दौड़ना।

Representative Results

ट्रांसक्रिप्शन सभी जीवों में जीन की अभिव्यक्ति में पहला कदम है। आर्किया में, प्रतिलेखन एक भी शाही सेना पोलीमरेज़ (RNAP) द्वारा किया जाता है। eukaryotes की तुलना में, अर्चेअल RNAP उनकी यूकेरियोटिक समकक्षों के एक सरल ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी जबकि करने के लिए एक हड़ताली संरचनात्मक सादृश्य भालू। इस प्रकार, आर्किया शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय (पोल द्वितीय) द्वारा यूकेरियोटिक प्रतिलेखन दीक्षा अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में, अर्चेअल आरएनए पोलीमर्स खुले परिसर का पूरा वास्तुकला एकल अणु झल्लाहट और एनपीएस से निर्धारित किया गया है। एनपीएस विश्लेषण से डेटा पूरा अर्चेअल खुला प्रमोटर जटिल है, जो प्रतिलेखन दीक्षा की व्यवस्था में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है की एक मॉडल का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

इस संरचना को स्पष्ट करने के लिए, smFRET क्षमता अज्ञात एंटीना डाई खुला प्रमोटर कॉम के भीतर स्थित अणुओं के बीच मापा गयाPlex और कई ज्ञात उपग्रह डाई अणु कि RNAP, जिसका पदों क्रिस्टेलोग्राफिक संरचनाओं (पी डी बी-आईडी: 2WAQ) से जाना जाता है में पांच संदर्भ साइटों पर शामिल किया गया 37। एंटीना रंगों गैर टेम्पलेट डीएनए, TFB, TBP या TFE पर विभिन्न पदों में से किसी एक से जुड़े थे। पूरा इस अध्ययन में इस्तेमाल किया नेटवर्क 60 से अधिक मापा दूरी शामिल थे।

चित्रा 7 एनपीएस विश्लेषण से बनाया पूरा अर्चेअल खुला प्रमोटर परिसर के मॉडल को दर्शाया गया है। यह डबल असहाय प्रमोटर डीएनए (प्रकाश और गहरे नीले रंग), आरएनए पोलीमरेज़ (ग्रे) और प्रतिलेखन दीक्षा TBP (बैंगनी) कारक शामिल हैं, TFB (हरा) और TFE (पीला)। मॉडल एनपीएस विश्लेषण, विश्वसनीय मात्रा में है, जो क्लासिक मॉडल (ए), आईएसओ मॉडल (बी) का उपयोग कर की गणना की गई, meanpos आईएसओ मॉडल (सी), वर-meanpos आईएसओ मॉडल से परिणामों के साथ आरोपित है (डी) और वर-meanpos मॉडल (ई)।

आकृति 1
चित्रा 1: अधिग्रहण और तेजी से एनपीएस गणना के लिए आवश्यक मापदंडों के प्रसंस्करण की कार्यप्रवाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एक smFRET घटना की अनुकरणीय प्रतिदीप्ति तीव्रता समय का पता लगाने। smFRET, द्वितीय: दाता (हरा) और स्वीकर्ता अणु (लाल) तीन चरणों विशेषता, अर्थात् मैं दिखाने का प्रतिदीप्ति तीव्रता दाता प्रतिदीप्ति स्वीकर्ता Photobleaching के बाद, तृतीय: दाता Photobleaching के बाद पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति।g2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: smFRET प्रयोगों के लिए प्रवाह चैम्बर के योजनाबद्ध चित्रण। प्रवाह कक्ष एक्रिलिक गिलास धारकों के साथ एक स्वनिर्धारित धातु धारक पर मुहिम शुरू की है। प्रवाह कक्ष की सैंडविच डिजाइन एक क्वार्ट्ज ग्लास (जुड़े सिलिका) इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग, एक सील फिल्म और एक coverslip कि प्रवाह कक्ष बंद कर देता है संलग्न करने के लिए दो छेद के साथ स्लाइड शामिल हैं। TIRF रोशनी के लिए चश्मे प्रवाह कक्ष के निचले आधे पर मुहिम शुरू की है। खोखले टैब शिकंजा प्रवाह कक्ष के लिए इनलेट और आउटलेट प्रदान करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

alt = "चित्रा 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" />
चित्रा 4: क्वार्ट्ज गिलास स्लाइड और सील फिल्म की तैयारी। क्वार्ट्ज गिलास स्लाइड के मैकेनिकल ड्राइंग छेद की स्थिति का संकेत (मिलीमीटर में दी गई है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रवाह कक्ष के मैकेनिकल ड्राइंग। एल्यूमीनियम चश्मे धारक के लिए उपाय, ग्लास धारकों और एल्यूमीनियम बढ़ते फ्रेम acryl मिलीमीटर में दिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

igure 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/>
चित्रा 6: चश्मे प्रकार TIRF smFRET प्रयोगों के लिए इस्तेमाल की स्थापना के योजनाबद्ध चित्रण। ऑप्टिकल घटकों के लिए संकेताक्षर: ए, एपर्चर; डीएम, dichroic दर्पण; एफ, उत्सर्जन फिल्टर; एल, लेंस; एम, दर्पण; हे, उद्देश्य; पी, चश्मे; Psd, स्थिति संवेदनशील फोटो डायोड; एस, नमूना; पुनश्च, पोजीशनिंग मंच; टी, दूरबीन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: अलग मॉडल मान्यताओं का अनुकरण का परिणाम है। सभी तस्वीरें अर्चेअल आरएनए पोलीमर्स दिखाने (पी डी बी-आईडी: 2WAQ, शीर्ष दृश्य) एक साथ प्रमोटर डीएनए (tDNA और नीले रंग में ntDNA और सियान, क्रमशः) के लिए मॉडल के साथ, TBP (बैंगनी), TFB (हरा) और TFE (पीला)अर्चेअल में खुलेगा जटिल 30। विश्वसनीय संस्करणों (ए) के क्लासिक मॉडल, (बी) आईएसओ मॉडल, (सी) meanpos आईएसओ मॉडल, (डी) वर-meanpos आईएसओ मॉडल और (ई) वर के एनपीएस सिमुलेशन परिणाम के लिए आरोपित कर रहे हैं -meanpos मॉडल। सभी संस्करणों 68% साख पर दिखाए जाते हैं। क्लासिक और वर-meanpos नेटवर्क smFRET डेटा के साथ संगत कर रहे हैं। इसके विपरीत, नेटवर्क, जहां सभी रंगों के लिए आईएसओ, meanpos-आईएसओ या वर-meanpos आईएसओ मॉडल चुना जाता है मापा डेटा के साथ असंगत हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया सही Biomacromolecules, यानी, न्यूक्लिक एसिड और / या प्रोटीन के लिए लचीला linkers के माध्यम से जुड़ा रंगों के बीच झल्लाहट क्षमता निर्धारित करने के लिए उपस्थित थे।

आदेश सटीक smFRET माप (धारा 3) यह सुनिश्चित करने के लिए, यह माप के दौरान किसी भी समय प्रवाह चैम्बर से हवा को बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, fluorophores के साथ प्रवाह कक्ष अधिभार नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें। fluorophores स्पष्ट रूप से सही विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए अलग किया जाना चाहिए। smFRET जोड़े, जो दाता के विरंजन नहीं दिखा विश्लेषण से बाहर रखा जाना है के रूप में, यकीन है कि देखने के क्षेत्र में अणुओं के> 80% फिल्म के अंत में प्रक्षालित कर रहे हैं। नमूना β-कारक और γ-फैक्टर में inhomogeneities के लिए खाते में करने के लिए, पार बात और रिश्तेदार दाता और स्वीकर्ता चैनल का पता लगाने के लिए क्षमता को सही करने, क्रमशः, प्रत्येक के लिए गणना कर रहे हैं झल्लाहट को व्यक्तिगत रूप से जोड़ी।

प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर (धारा 7 से 9) पर माप के लिए संकेत तीव्रता और दर्ज आंकड़ों के वर्णक्रम संकल्प के बीच एक अच्छा समझौता हो पाया है। यह अंत करने के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर की उत्तेजना और उत्सर्जन मार्ग में slits इस्तेमाल साधन और नमूना एकाग्रता पर निर्भर है अनुकूलित किया जाना है।

इसके अलावा, हम क्षणिक या गतिशील MACROM के संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए तेजी से एनपीएस विश्लेषण विधि प्रस्तुतolecular परिसरों। एनपीएस गैर टेम्पलेट डीएनए किनारा का पथ और अर्चेअल आरएनए पोलीमर्स खुले परिसर में प्रतिलेखन दीक्षा कारकों की स्थिति को प्रकट करने के लिए लागू किया गया है। 60 से अधिक विभिन्न दूरी माप के नेटवर्क का उपयोग, हम पता चला है कि फास्ट एनपीएस, एक हाल में लागू नमूना इंजन (Eilert, टी, Beckers, एम, Drechsler, एफ, और Michaelis, तैयारी में जे) के साथ सुसज्जित, समय मूल वैश्विक एनपीएस विधि 27 की तुलना में, परिमाण के ≈2 आदेश से इस जटिल smFRET नेटवर्क के विश्लेषण के लिए आवश्यक कम कर देता है। एल्गोरिथ्म की मजबूती के एक महानगर के भीतर गिब्स नमूना एक समानांतर तड़के योजना के साथ संयुक्त में निहित है। फास्ट एनपीएस नेटवर्क परिणामों की सही reproducibility पता चलता है और पहले 30 प्रकाशित परिणामों के साथ संगत है।

कई अलग अलग तरीकों smFRET माप 11 से संरचनात्मक जानकारी अनुमान करने के लिए लक्ष्य प्रकाशित किया गया है अप>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18। इन तरीकों के सभी केवल एक विशिष्ट डाई मॉडल प्रदान करते हैं। इस प्रकार, रंग, कि संबंधित मॉडल के आधार पर बनाया मान्यताओं को पूरा नहीं करते हैं, नहीं किया जा सकता है या गलत जानकारी संरचनात्मक पैदा होती हैं। फास्ट एनपीएस, इसके विपरीत, प्रत्येक डाई अणु एक अलग मॉडल के लिए चयन करने के लिए अनुमति देता है। यह दोनों के अलग-अलग गठनात्मक व्यवहार के लिए खाते में मदद करता है, डाई अणु ही है, साथ ही साथ अपने लगाव के लिए इस्तेमाल किया लिंकर। डाई अणु की स्थानीय आणविक परिवेश, साथ ही इसकी भौतिक गुणों का निर्धारण करेगा जो मॉडल सबसे उपयुक्त है।

अर्चेअल दीक्षा परिसर का विश्लेषण किया smFRET नेटवर्क के लिए, सभी डाई अणुओं के लिए एक isotropic धारणा भारी कमी की ओर जाता रहाn विश्वसनीय वॉल्यूम के आकार क्लासिक मॉडल की तुलना में। सभी डाई के लिए औसत एक गतिशील स्थिति के साथ संयोजन में सभी विश्वसनीय मात्रा आकार के मंझला अणुओं (95% से कम) कम से कम 0.5 एनएम 3 को कम कर देता है। हालांकि, इन डाई अणु कूल्हे का संकेत है कि मान्यताओं झूठी संरचनात्मक जानकारी के लिए नेतृत्व बनाया उनकी smFRET माप के साथ नहीं रह संगत कर रहे हैं। इसके विपरीत, क्लासिक मॉडल में निर्धारित कूल्हे चुना गया smFRET क्षमता के साथ संगत कर रहे हैं।

सभी रंगों के लिए औसत isotropic और / या गतिशील स्थिति की धारणा के रूप में विसंगतियों के लिए नेतृत्व, फास्ट-एनपीएस डाई अणु Priors जिसमें प्रत्येक डाई पांच मॉडलों में से एक सौंपा जा सकता है सक्षम बनाता है। प्रत्येक मॉडल ही सुलभ मात्रा का उपयोग करता है। डाई AVs की गणना के लिए एल्गोरिथ्म कई मान्यताओं बनाता है। सबसे पहले, fluorophore के स्थानिक आकार एक क्षेत्र द्वारा अनुमानित है। इस प्रकार, एक व्यास अकाउंट fluorophore के wid में लेवें, ऊंचाई और मोटाई (धारा 12) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, लिंकर का आकार एक लचीली छड़ी द्वारा अनुमानित है। धारा 12 में प्रस्तुत मूल्यों डाई एलेक्सा 647 एक 12-सी लिंकर के माध्यम से जुड़ा के लिए गणना कर रहे थे। तिथि करने के लिए, यह संभव नहीं सही एक प्राथमिकताओं जो मॉडल सबसे उपयुक्त है निर्धारित करने के लिए, यह देखते हुए एक प्रायोगिक ज्यामिति है, और इस तरह के सभी मॉडल का परीक्षण किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, एक, मॉडल है जो छोटी संभव पीछे आकार देता है का चयन करेंगे, जबकि अभी भी डेटा के साथ संगत किया जा रहा है। कि क्या मॉडलों में से एक विकल्प smFRET डेटा के साथ संगत है परीक्षण करने के लिए, हम दोनों पीछे और संभावना की गणना। संगति का मतलब है कि पीछे से एकत्र नमूनों की 90% से अधिक संभावना के 95% विश्वास अंतराल के भीतर हैं।

हालांकि यह सच है कम anisotropy, छोटी दूरी अनिश्चितता, एक smFRET नेटवर्क में डाई अणु के ज्यामितीय व्यवस्था को भी ध्यान में रखा जाना है। इस प्रकार, जबकि आरएक आईएसओ मॉडल के साथ एक कम प्रतिदीप्ति anisotropy साथ डाई अणु epresenting एक ठेठ पहली पसंद है, स्थिरता परीक्षण सही डाई मॉडल का चयन करने के लिए एक और अधिक प्रत्यक्ष साधन प्रदान करता है। डाई मॉडल के इष्टतम पसंद स्थानीयकरण परिशुद्धता में भारी वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और एक ही समय में अपनी झल्लाहट डेटा के साथ नेटवर्क की निरंतरता बनाए रखने के लिए।

संक्षेप में, तेजी से एनपीएस बड़े macromolecular परिसर के संरचनात्मक और गतिशील जानकारी हासिल करने के लिए अनुमति देता है। इस तरह के एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस अत्यधिक लचीला या क्षणिक परिसरों की निगरानी, ​​इस प्रकार बहुत जटिल जैविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को यंत्रवत को चौड़ा करने के लिए अनुमति देता है के रूप में आम संरचनात्मक तरीकों के विपरीत।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flowchamber preparation
Customized metall sample holder self-built n/a
quartz-glass slides, 76 mm x 26 mm Technical Glass Products 26007
coverslips, 60 mm x 24 mm Marienfeld 101242
detergent, Hellmanex II Hellma 320.001
ultra-pure water from Synergy UV Millipore 2512600
Zepto plasma cleaner Diener n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a. Sigma-Aldrich A3648
methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. MPEG-SVA-5000-1g
biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa Laysan Bio Inc. BIOTIN-PEG-SVA-5000
Sodium biocarbonate Sigma-Aldrich S5761 Sigma 
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S2127 Sigma-Aldrich 
sealing film (Nescofilm) Fisher Scientific 12981805
Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD Saint-Gobain Performance Plastics 720958
Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical) Fisher Scientific 12665497
Neutravidin Life Technologies A2666
Total internal reflection fluorescence microscope
Nd:YAG Laser, 532 nm Newport Spectra-Physics EXLSR-532-100-CDRH
diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso Cobolt 904010050
diode laser 643 nm, iBeam smart Toptica iBEAM-SMART-640-S
dichroic mirror, 532 RDC Chroma F33-540
dichroic mirror, 476 RDC Chroma F33-476z
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic AOTFnC-VIS
plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm Thorlabs LJ1703L1-A
plano-concave cylindrical, f = -300 mm Thorlabs
prism, PS 991 Thorlabs PS991
focusing lens, f = 75 mm Thorlabs LA1608-B
syringe pump, PHD 2000 Harvard Apparatus 70-2002
2 stepper motors, Z812B Thorlabs Z812B
piezoelectric actuator, PE4 Thorlabs PE4
IR diode laser Edmund Optics CPS808 part of the autofocus system
dichroic mirror, 775 DCXR Chroma 775 DCXR
position-sensing detector (PSD), PDP90A Thorlabs PDP90A part of the autofocus system
water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2 Nikon MRD07601
dichroic mirror, 645 DCXR Chroma 645 DCXR part of the emission pathway
emission filter, 3RD550-510 Omega Optical 3RD550-510 green channel in the emission pathway
emission filter, 3RD660-760 Omega Optical 3RD660-760 red channel in the emission pathway
EMCCD camera, iXon+ DU897EBV Andor AND-20-00032
EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV Andor AND-20-000141
Miscellaneous
Varian 50 Cary UV-VIS spectrometer
Fluorolog2 SPEX fluorescence spectrometer
Solis (V4.15) Andor control software for the EM-CCD camera
Apt user utility  (V1.022) Thorlabs control software for the piezo-motors
Norland Optical Adhesive 68 Thorlabs adhesive
PC-AFN-0.8 Nile red Kisker Biotech avidin-coated fluorescent multispec beads 
Matlab Mathworks technical computing language for custon written software
Origin (V9.0) Originlab scientific graphing and data analysis software
Hellma 105-202-15-40 Hellma 105-202-15-40 absorption cuvette of 1 cm path length
Hellma 105-251-15-40 Hellma 105-251-15-40 fluorescence cuvette with 3 mm path length

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References

  1. Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
  2. Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
  3. Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
  4. Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
  5. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
  6. Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
  7. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  8. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
  9. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
  12. Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
  13. Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
  14. Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  15. Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
  16. Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
  17. Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
  18. Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
  19. Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  20. McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
  21. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
  22. Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
  23. Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  24. Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
  25. Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
  26. Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  27. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  28. Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  29. Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
  30. Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).
  31. Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
  32. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
  33. Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
  34. Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549 (2014).
  35. Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
  36. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. Boston, MA. (2006).
  37. Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).

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Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J. Vis. Exp. (120), e54782, doi:10.3791/54782 (2017).

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