לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.
Introduction
biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. 1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. 3,4
Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. 5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. 7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. 10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. 12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה.
מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. 15 biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. 16 בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק.
בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB מודה מלגת מחקר מקנדה סיסטיק פיברוזיס.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
