Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell'ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell'ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell'ospite-derivati in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.
Introduction
biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l'uno all'altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. 1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all'interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell'ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente biofouling, corrosione e blocchi. 3,4
I biofilm sono anche critici in ambienti sanitari, in quanto è stato dimostrato essere coinvolti nelle infezioni correlate al catetere, infezioni polmonari nei pazienti affetti da fibrosi cistica, così come in numerose altre infezioni. 5,6 Una delle caratteristiche di infezioni biofilm è la desgualcita sensibilità dei batteri agli antibiotici e compromessa rinvio del sistema immunitario innato. 7-9 Il più studiati, scenari clinicamente rilevanti che coinvolgono infezione biofilm-based si verifica in pazienti affetti da fibrosi cistica (FC), che sono cronicamente infettati con Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa può subire una serie di modifiche durante la creazione di infezione cronica che lo rendono molto difficile da trattare. 10,11 I biofilm possono differenziale attivare l'immunità innata e guidare l'infiammazione. 12-14 Poiché queste infezioni portano ad un aumento della morbilità e mortalità nei pazienti con FC, è fondamentale per capire i fattori che possono influenzare lo sviluppo del biofilm in questo contesto.
Un recente studio suggerisce che ospitano-fattori critici nella formazione di P. aeruginosa aggregati biofilm. 15 Questi biofilm contribuiscono alla ridotta sensibilità agli antibiotici e meccanismi di difesa dell'ospite. il PreseSNO di fattori dell'ospite-derivati, come elastasi neutrofila, così come i prodotti secreti da microrganismi presenti nel polmone CF, hanno il potenziale di modulare notevolmente la formazione di biofilm e sviluppo. 16 Inoltre, biofilm interagiscono con l'host di modulare l'espressione di numerosi percorsi e avviare l'infiammazione. Mentre i metodi high throughput, quali il test cristalvioletto standard possono fornire alcune informazioni per quanto riguarda il processo di biofilm, visualizzazione del biofilm in risposta a questi fattori fornire informazioni più approfondite.
In questo manoscritto si descrive un metodo per l'utilizzo di fattori dalla nell'espettorato di pazienti con FC per studiare lo sviluppo di biofilm in vitro. Questo metodo consente la visualizzazione rapida dei biofilm esposti a espettorato contenente fattori host utilizzando un kit di biofilm redditività commerciale. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare visivamente i cambiamenti che si verificano durante la crescita di biofilm in presenza di exogenonoi prodotti, e rappresenta un metodo migliore per analizzare i cambiamenti nello sviluppo del biofilm in varie condizioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l'effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Ino…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB riconosce un assegno di ricerca da Fibrosi Cistica Canada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
