Immunokleuring van biocytine gevuld en Verwerkte secties voor Neurochemische Markers
Summary
Dit protocol geeft een werkwijze voor de morfologische herstel van neuronen patched tijdens elektrofysiologische opnames via biocytine vullen en immunohistochemische latere nabewerking. We laten zien dat dikke-biocytine gevuld secties die werden gekleurd en afgedekt kunnen worden restained met een tweede primair antilichaam dagen of maanden later.
Abstract
Elektrofysiologische registraties van cellen met behulp van de patch clamp techniek hebben geleid tot de identificatie van verschillende neuronale types gebaseerd op afvuren patronen. De opname van biocytine / neurobiotin in de registratie-elektrode maakt post-hoc terugwinning van morfologische gegevens, die benodigd zijn om dendritische arborization en het doelwit van de axonen van de neuronen opgenomen gebieden bepalen. Echter, gezien de aanwezigheid van morfologisch vergelijkbaar met verschillende neuronen neurochemische identiteit en functie, immunohistochemische kleuring voor celtype-specifieke eiwitten essentieel definitief neuronen te identificeren. Netwerkverbindingen behouden worden hersensecties voor fysiologische opnames bereid bij een dikte van 300 urn of meer. Echter, deze dikte belemmert vaak immunohistologische postprocessing te wijten aan problemen met antilichaam penetratie, noodzakelijk de resectioning van het weefsel. Resectioning plakken is een uitdagende kunst, vaak resulting in het verlies van weefsel en morfologie van de cellen waaruit elektrofysiologische gegevens zijn verkregen, waardoor de gegevens onbruikbaar. Sinds het herstel van de morfologie zou het verlies van gegevens en gids bij de selectie van neuronale markers te beperken, hebben we een strategie voor het winnen van celmorfologie eerste plaats, gevolgd door secundaire immunokleuring aangenomen. We introduceren een praktische benadering van biocytine vullen tijdens fysiologische opnames en de daaropvolgende periodieke immunokleuring voor het herstel van de morfologie, gevolgd door het beitsen van secties om de neurochemische identiteit vast te stellen. Wij rapporteren dat delen die waren gevuld met biocytine, gefixeerd met paraformaldehyde (PFA), gekleurd en afgedekt kunnen worden verwijderd en restained met een tweede primair antilichaam dagen later. Dit beitsen is de verwijdering van het dekglaasje, het wassen van onderdelen in een bufferoplossing, en de incubatie van primaire en secundaire antilichamen tegen de neurochemische identiteit bekend. De werkwijze is voordelig voor het elimineren DATeen verlies als gevolg van een onvermogen om de morfologie te herstellen en voor het verkleinen van de neurochemische markers te testen op basis van de morfologie.
Introduction
De hersenen staat bekend om de diversiteit in de structurele en functionele kenmerken van de individuele neuronale elementen. Inzicht in de rollen van verschillende neuronale types in de hersenfunctie en pathologie vereist karakterisering en ondubbelzinnige identificatie van neuronen. Structureel, de morfologische kenmerken gedefinieerd door somato-dendritische locatie te bepalen de mogelijke ingangen die een bepaalde neuron ontvangt, terwijl het patroon van axonale arborization identificeert potentiële postsynaptische targets. De structurele diversiteit van neuronen is gewaardeerd sinds de dagen van Ramón y Cajal's rudimentaire histologische studies 1. De komst van single-cell opnametechnieken bleek dat structureel verschillende neuronen verschillen in afvuren patronen en synaptische kenmerken tonen ook. De diversiteit in de structuur en fysiologie is vooral duidelijk in GABAergic remmende neuronen 2,3. Bovendien, is het steeds duidelijker geworden dat structurally vergelijkbaar neuronen kunnen verschillende neurochemische merkers en tonen overeenkomstige functionele 4 verschillen uit te drukken. Ook neuronen met dezelfde neurochemische merkers kunnen verschillende structuren en functies 5-10 hebben. Dus in de praktijk, de analyse van de functionele eigenschappen van neuronen en hun rol in het netwerk vereist de definitie zowel de morfologische en neurochemische identiteiten. Zelfs met de komst van reporter muizenlijnen gericht op specifieke neurochemische markers, is het vaak noodzakelijk om de morfologie en subtype identiteit bepalen op basis van immunohistochemische 11.
De standaard methode gebruikt om cellen die in acute hersenen plakjes te karakteriseren is om ze te vullen met biocytine of neurobiotin tijdens de opname, de secties in paraformaldehyde (PFA) na de opnames vast te stellen, en het gebruik van immunohistochemie om de morfologie en neurochemie onthullen. Aangezien de dikte van de punten voor segment fysiologie typisch 300 urnof meer, en omdat de meeste antilichamen niet helemaal doordringen die diepte, moeten de segmenten opnieuw worden coupes te 60 micrometer om gelijktijdige immunokleuring voor biocytine en neurochemische merkers 12-14. Helaas, resectioning is bewerkelijk; riskeert het verlies van weefsel tijdens het snijden; en kan leiden tot differentiële weefsel krimp, complicerende morfologische reconstructies. Bovendien kan de voorkennis van de morfologie helpen beperken de kandidaat markers die waarschijnlijk door de cellen tot expressie te brengen zijn. We hebben de standaard biocytine immunohistologie protocollen aangepast om seriële verwerking van afdelingen mogelijk eerst voor het herstel van de morfologie en vervolgens voor de identificatie van mogelijke neurochemische markers.
Immunohistochemie is de studie van antigeen verdeling in weefsels en cellen en kan worden gevisualiseerd met behulp van een enzym, fluorescerende labels, radioactieve elementen of colloïdaal goud partikels 15. De procedure involves behulp primaire antilichamen specifiek amplificeren label en één of meer antigenen, gevolgd door het gebruik van fluorescente secundaire antilichamen gericht op het primaire antilichaam voor visualisatie. Vanwege de noodzaak om de fluorescentie spectra van elke secundaire antilichaam onderscheiden zonder overlap, kan slechts een beperkt aantal antigenen gelijktijdig worden onderzocht. Aldus kan voorkennis morfologie bruikbaar zijn bij het selecteren van de gegadigde neurochemische merkers voor cellulaire indeling zijn. Conceptueel is de ratio seriële verwerking van al-gekleurde coupes gebaseerd op de vooronderstelling dat immunokleuring voor één eiwit of peptide raakt niet aan antigeniciteit en daaropvolgende immunokleuring voor een structureel onafhankelijk peptide 16. Dit gebrek aan interferentie wordt veroorzaakt door de binding van de antilichamen tegen een specifiek eiwit epitoop op een antigeen en derhalve voorziet in de gelijktijdige kleuring van meerdere antigenen in hetzelfde weefsel. Het aantal antigenen revealed door immunokleuring wordt beperkt door de behoefte aan niet-overlappende spectra van fluorescente secundaire antilichamen en door de noodzaak om individuele antigenen met antilichamen opgewekt bij diverse soorten richten teneinde elimineren kruisreactiviteit 17,18. Hoewel dit de redenering achter seriële plaats gelijktijdige labeling met twee verschillende antilichamen die kunnen interageren, voorzover ons bekend, immunokleuring voor een tweede antigeen is niet gemeld na voltooiing van immunokleuring voor één of meer antigenen op gemonteerde profielen. Hier beschrijven we een werkwijze voor seriële immunokleuring van eerder bevlekt en gemonteerde profielen. Hoewel we detail het proces voor een seriële immunokleuring procedure voor het terugwinnen van morfologie, gevolgd door kleuring op eiwit / peptide markers in dikke gedeelten kunnen dezelfde procedures worden gebruikt in standaard, dunne coupes ook. Daarnaast beschrijven we een praktische benadering opgenomen neuronen met biocytine en het proces om het los te vullenelektrode van de cel na voltooiing van opnames voor het vullen van de axonale en dendritische assen van neuronen te optimaliseren, zoals beschreven in onze recente werk 6,8.
Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven werkwijze is dat de morfologie van de cel opgenomen kan volledig worden hersteld en afgebeeld alvorens resectie of immunostain de segmenten. Hoewel problemen met de penetratie van bepaalde antilichamen het noodzakelijk om resectie plakken voor secundaire immunokleuring kunnen maken, zouden de procedures hier beschreven de noodzaak om complexe neuronen van meerdere secties te reconstrueren uitschakelen, zodat problemen als gevolg van weefsel verlies en differentiële krimp te vermijden, die de wederopbouw in gevaar kunnen brengen volgende resectioning. Een bijkomend voordeel is dat het proces kosten, tijd, inspanning en dure antilichamen zullen beperken doordat immunokleuring en opnieuw snijden plakjes waarin biocytine-gevulde neuronen worden teruggewonnen. De meest praktische aspect is de advertentiemende immunokleuring die kunnen worden uitgevoerd op secties gekleurd maanden voordat de bovengenoemde techniek. Met name zou het herstel van de morfologie aanzienlijk het potentieel dat fysiologische gegevens uit de cellen wordt verwijderd als gevolg van een onvermogen om een fundamentele morfologische karakterisering van het celtype te verkrijgen te verminderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Het vullen van de gepatchte cel met biocytine is de meest cruciale stap om het volledige herstel van de morfologie te waarborgen. Voor volledig herstel van de cel, is het essentieel om een optimale segment oriëntatie selecteren om het verbreken van zo laag mogelijk houden tijdens het snijden. Deze oriëntatie kan verschillen op basis van het circuit en celtype in behandeling. Vervolgens is het noodzakelijk om voldoende de biocytine te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de steun van NIH / NINDS R01 NS069861 en NJCBIR CBIR14IRG024 te erkennen VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -. B., Yang, P. -. C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. . Concepts in Viral Pathogenesis II. , 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. . Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , (2007).
- Molnar, P. . Patch-clamp methods and protocols. 403, (2007).
- Martina, M., Taverna, S. . Patch-clamp methods and protocols. , (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny ‘fast-spiking’ cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
