Neurochemical मार्करों के लिए Biocytin-भरा और प्रसंस्कृत धारा के Immunostaining
Summary
इस प्रोटोकॉल biocytin भरने और बाद प्रतिरक्षाऊतकरसायन postprocessing का उपयोग कर electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान समझौता न्यूरॉन्स की रूपात्मक वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। हम बताते हैं कि मोटी biocytin से भरे वर्गों है कि दाग और coverslipped रहे थे एक दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी दिनों या महीनों बाद साथ restained जा सकता है।
Abstract
पैच दबाना तकनीक का उपयोग कोशिकाओं की electrophysiological रिकॉर्डिंग अलग neuronal फायरिंग पैटर्न पर आधारित प्रकार की पहचान के लिए अनुमति दी है। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड में biocytin / Neurobiotin के शामिल किए जाने रूपात्मक विवरण, जो वृक्ष के समान द्रुमायण और क्षेत्रों दर्ज न्यूरॉन्स के axons द्वारा लक्षित निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं के पद अस्थायी वसूली परमिट। हालांकि, अलग नयूरोचेमिकल पहचान और कार्यों, सेल प्रकार विशिष्ट प्रोटीन के लिए immunohistochemical धुंधला के साथ आकृति विज्ञान के समान न्यूरॉन्स की उपस्थिति को देखते हुए निश्चित न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए आवश्यक है। नेटवर्क कनेक्टिविटी बनाए रखने के लिए, शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क वर्गों 300 माइक्रोन या अधिक से अधिक की मोटाई पर तैयार कर रहे हैं। हालांकि, इस मोटाई अक्सर एंटीबॉडी पैठ के साथ मुद्दों के कारण immunohistological postprocessing hinders, ऊतक के resectioning की जरूरत महसूस। स्लाइस की Resectioning एक चुनौतीपूर्ण कला है, अक्सर resulऊतकों और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के नुकसान में टिंग से electrophysiological डेटा प्राप्त हुई थी, डेटा को अनुपयोगी बताते हुए। आकृति विज्ञान डेटा हानि और neuronal मार्कर के चयन में गाइड की सीमा होती है की वसूली के बाद से, हम पहले सेल आकृति विज्ञान उबरने की रणनीति, माध्यमिक immunostaining द्वारा पीछा किया अपनाया है। हम शारीरिक रिकॉर्डिंग और आकृति विज्ञान की वसूली के लिए बाद में सीरियल immunostaining, नयूरोचेमिकल पहचान निर्धारित करने के लिए वर्गों के restaining के द्वारा पीछा के दौरान भरने biocytin लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण का परिचय। हम रिपोर्ट है कि वर्गों है कि biocytin से भर गए, paraformaldehyde के साथ तय (पीएफए), दाग, और coverslipped हटा दिया है और एक दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दिन बाद restained जा सकता है। इस restaining coverslip के हटाने, एक बफर समाधान में वर्गों की धुलाई, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के ऊष्मायन नयूरोचेमिकल पहचान उजागर करने के लिए शामिल है। विधि Dat को नष्ट करने के लिए फायदेमंद हैआकृति विज्ञान को ठीक करने में असमर्थता के कारण और नयूरोचेमिकल मार्कर के नीचे संकुचन के लिए एक नुकसान आकृति विज्ञान के आधार पर परीक्षण किया जाना है।
Introduction
मस्तिष्क अपने व्यक्तिगत न्यूरोनल तत्वों की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं में विविधता के लिए जाना जाता है। मस्तिष्क समारोह और विकृति में अलग neuronal प्रकार की भूमिकाओं को समझना लक्षण और न्यूरॉन्स की स्पष्ट पहचान की आवश्यकता है। संरचनात्मक, रूपात्मक सुविधाओं somato-वृक्ष के समान स्थान के आधार पर परिभाषित किया गया, संभावित जानकारी है कि एक दिया न्यूरॉन प्राप्त निर्धारित जबकि axonal द्रुमायण के पैटर्न संभावित पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों को पहचानती है। न्यूरॉन्स की संरचनात्मक विविधता रेमन y Cajal के मौलिक ऊतकीय अध्ययनों 1 के दिनों से सराहना की गई है। एकल कोशिका रिकॉर्डिंग तकनीकों के आगमन से पता चला है कि संरचनात्मक रूप से अलग न्यूरॉन्स भी फायरिंग पैटर्न और synaptic विशेषताओं में मतभेद दिखा। संरचना और शरीर विज्ञान में विविधता GABAergic निरोधात्मक न्यूरॉन्स 2,3 में विशेष रूप से स्पष्ट है। इसके अलावा, यह है कि structurall तेजी से स्पष्ट हो गया हैY समान न्यूरॉन्स अलग नयूरोचेमिकल मार्कर के और दिखाने के लिए इसी 4 कार्यात्मक मतभेद व्यक्त कर सकते हैं। इसी तरह, एक ही नयूरोचेमिकल मार्कर के साथ न्यूरॉन्स अलग संरचना और कार्य 5-10 हो सकता है। इस प्रकार, व्यवहार में, नेटवर्क में न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विशेषताओं का विश्लेषण और उनकी भूमिका दोनों रूपात्मक और नयूरोचेमिकल पहचान को परिभाषित करने पर जोर देता। यहाँ तक कि संवाददाता माउस विशिष्ट नयूरोचेमिकल मार्कर को निशाना लाइनों के आगमन के साथ, यह अक्सर immunohistology 11 के आधार पर आकृति विज्ञान और उप प्रकार पहचान निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।
मानक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में दर्ज की कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया विधि, रिकॉर्डिंग के दौरान biocytin या Neurobiotin साथ उन्हें भरने paraformaldehyde में वर्गों (पीएफए) रिकॉर्डिंग के बाद ठीक है, और आकृति विज्ञान और neurochemistry प्रकट करने के लिए immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए है। टुकड़ा शरीर क्रिया विज्ञान के लिए वर्गों की मोटाई के बाद आम तौर पर 300 माइक्रोन हैंया अधिक है, और क्योंकि ज्यादातर एंटीबॉडी कि गहराई के माध्यम से सभी तरह घुसना करने में विफल है, स्लाइस biocytin और नयूरोचेमिकल मार्कर 12-14 के लिए एक साथ immunostaining के लिए अनुमति देने के लिए 60 माइक्रोन या कम करने के लिए फिर से sectioned किए जाने की जरूरत है। दुर्भाग्य से, resectioning श्रमसाध्य है; सेक्शनिंग के दौरान ऊतक के नुकसान के जोखिम; और रूपात्मक पुनर्निर्माण उलझी ऊतक संकोचन करने के लिए अंतर पैदा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, आकृति विज्ञान के पूर्व ज्ञान के उम्मीदवार मार्करों कि कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाने की संभावना है नीचे संकीर्ण मदद कर सकता है। हम मानक biocytin immunohistology प्रोटोकॉल को संशोधित किया है आकृति विज्ञान की वसूली के लिए और पहले तो संभावित नयूरोचेमिकल मार्कर की पहचान के लिए वर्गों के धारावाहिक प्रसंस्करण की अनुमति है।
Immunohistochemistry ऊतकों या कोशिकाओं में प्रतिजन वितरण का अध्ययन किया जाता है और एक एंजाइम, फ्लोरोसेंट लेबल, रेडियोधर्मी तत्वों, या सोने के कणों कोलाइड 15 का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। प्रक्रिया मैंप्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग विशेष रूप से टैग और एक या एक से अधिक विशिष्ट एंटीजन, दृश्य के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को निशाना फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के बाद बढ़ाना nvolves। ओवरलैप के बिना प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा अलग की जरूरत के कारण, केवल एंटीजन की एक सीमित संख्या में एक साथ जांच की जा सकती है। इस प्रकार, आकृति विज्ञान के पूर्व ज्ञान सेल वर्गीकरण के लिए उम्मीदवार नयूरोचेमिकल मार्कर का चयन करने में उपयोगी हो सकता है। धारणा, पहले से ही दाग वर्गों के धारावाहिक प्रसंस्करण के पीछे तर्क आधार यह है कि एक प्रोटीन या पेप्टाइड के लिए immunolabeling एक संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र पेप्टाइड 16 के लिए प्रतिजनकता और बाद immunolabeling के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए पर आधारित है। हस्तक्षेप की यह कमी एक प्रतिजन पर एक विशेष प्रोटीन मिलान के लिए एंटीबॉडी के बंधन की वजह से है और इसलिए एक ही ऊतक में कई एंटीजन के एक साथ धुंधला के लिए अनुमति देता है। एंटीजन की संख्या revealeडी immunostaining द्वारा फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के लिए जरूरत से और इतने के रूप में पार जेट 17,18 समाप्त करने के लिए विभिन्न प्रजातियों में उठाया एंटीबॉडी के साथ अलग-अलग एंटीजन लक्ष्य की जरूरत द्वारा सीमित है। हालांकि यह दो अलग एंटीबॉडी कि हमारे ज्ञान करने के लिए बातचीत कर सकते हैं, एक दूसरे प्रतिजन के लिए मुहिम शुरू की immunostaining वर्गों पर एक या एक से अधिक एंटीजन के लिए immunolabeling के पूरा होने के बाद सूचना नहीं किया गया है के साथ धारावाहिक के बजाय एक साथ लेबलिंग के पीछे तर्क है। यहाँ, हम पहले से सना हुआ और घुड़सवार वर्गों के धारावाहिक immunostaining के लिए एक विधि का वर्णन। जब तक हम आकृति विज्ञान की वसूली मोटी वर्गों में प्रोटीन / पेप्टाइड मार्करों के लिए धुंधला द्वारा पीछा के लिए एक सीरियल immunolabeling प्रक्रिया के लिए इस प्रक्रिया को विस्तार से, एक ही प्रक्रियाओं मानक में, पतली ऊतकीय वर्गों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, हम biocytin और इस प्रक्रिया को बेदखल करने के साथ दर्ज न्यूरॉन्स को भरने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण का वर्णनके रूप में हमारे हाल ही में काम 6,8 में प्रस्तुत रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर सेल से इलेक्ट्रोड, axonal और न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान arbors के भरने के अनुकूलन के लिए।
प्रक्रिया यहाँ वर्णित का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि दर्ज सेल की आकृति विज्ञान पूरी तरह से ठीक किया जा सकता है और लकीर करने के लिए या स्लाइस immunostain प्रयास करने से पहले छवि उतारी है। कुछ एंटीबॉडी के प्रवेश के साथ मुद्दों को यह माध्यमिक immunostaining के लिए लकीर स्लाइस करने के लिए आवश्यक प्रदान कर सकते हैं हालांकि, प्रक्रियाओं यहाँ विस्तृत कई वर्गों से जटिल न्यूरॉन्स फिर से संगठित करने की आवश्यकता को समाप्त होगा और ऊतकों को नुकसान और अंतर सिकुड़न के कारण मुद्दों से बचना होगा, जो पुनर्निर्माण समझौता कर सकते हैं resectioning के बाद। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि इस प्रक्रिया immunostaining और स्लाइस, जिसमें biocytin से भरे न्यूरॉन्स बरामद कर रहे हैं करने के लिए फिर से सेक्शनिंग सीमित द्वारा लागत, समय, प्रयास और महंगा एंटीबॉडी कम हो जाएगा। सबसे अधिक व्यावहारिक पहलू विज्ञापनपारंपरिक immunostaining कि ऊपर उल्लिखित तकनीक का उपयोग करने से पहले वर्गों दाग महीने पर किया जा सकता है। विशेष रूप से, आकृति विज्ञान की वसूली में काफी क्षमता है कि कोशिकाओं से शारीरिक डेटा सेल प्रकार की एक बुनियादी रूपात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने में असमर्थता के कारण खारिज कर दिया है कम होगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
biocytin के साथ समझौता सेल भरने सबसे महत्वपूर्ण कदम आकृति विज्ञान की पूरी वसूली सुनिश्चित करने के लिए है। सेल की पूरी वसूली के लिए, यह टुकड़ा करने की क्रिय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों बनाम एनआईएच / NINDS R01 NS069861 और NJCBIR CBIR14IRG024 से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
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