Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori
Summary
Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.
Abstract
registrazioni elettrofisiologiche di cellule utilizzando la tecnica del patch clamp hanno permesso l'identificazione di diversi tipi neuronali basate su modelli di cottura. L'inclusione di biocitina / neurobiotin nel elettrodo di registrazione permette il recupero post-hoc dei dettagli morfologici, che sono necessari per determinare la arborizzazione dendritiche e le regioni interessate dagli assoni dei neuroni registrati. Tuttavia, data la presenza di neuroni morfologicamente simili con identità distinte neurochimiche e funzioni, colorazione immunoistochimica per le proteine-specifica delle cellule-tipo è essenziale per identificare definitivamente i neuroni. Per mantenere la connettività di rete, sezioni di cervello per le registrazioni fisiologiche sono preparati ad uno spessore di 300 micron o superiore. Tuttavia, questo spessore spesso ostacola la post-elaborazione immunoistologiche causa di problemi con la penetrazione degli anticorpi, che richiede la resezione del tessuto. Resezione di fette è un'arte difficile, spesso Resulting nella perdita di tessuto e la morfologia delle cellule da cui sono stati ottenuti i dati elettrofisiologici, rendendo i dati inutilizzabili. Poiché il recupero della morfologia limiterebbe perdita di dati e guida nella scelta dei marcatori neuronali, abbiamo adottato una strategia di recuperare morfologia cellulare prima, seguita da immunocolorazione secondaria. Introduciamo un approccio pratico per biocitina riempimento durante le registrazioni fisiologiche e successiva immunostaining seriale per il recupero di morfologia, seguita dalla restaining delle sezioni per determinare l'identità neurochimico. Si segnala che le sezioni che erano pieni di biocitina, fissate con paraformaldeide (PFA), macchiati, e coprioggetto possono essere rimossi e ricolorate con un secondo anticorpo primario giorni successivi. Questo restaining comporta la rimozione del vetrino, il lavaggio delle sezioni in una soluzione tampone, e l'incubazione di anticorpi primari e secondari per rivelare l'identità neurochimico. Il metodo è vantaggioso per eliminare datuna perdita a causa di una incapacità di recuperare la morfologia e per restringendo i marcatori neurochimici da sottoporre a test sulla base di morfologia.
Introduction
Il cervello è noto per la diversità nelle caratteristiche strutturali e funzionali dei singoli elementi neuronali. La comprensione dei ruoli di tipi neuronali distinti in funzione del cervello e patologia richiede caratterizzazione e identificazione univoca dei neuroni. Strutturalmente, le caratteristiche morfologiche definite dalla posizione somato-dendritiche determinare il potenziale di input che riceve un dato neurone, mentre il modello di arborization assonale identifica potenziali obiettivi post-sinaptici. La diversità strutturale dei neuroni è stato apprezzato fin dai tempi di seminali studi istologici di Ramon y Cajal 1. L'avvento di tecniche di registrazione unicellulari ha rivelato che i neuroni strutturalmente distinti mostrano anche differenze nei modelli di cottura e le caratteristiche sinaptiche. La diversità nella struttura e la fisiologia è particolarmente evidente nei neuroni inibitori GABAergici 2,3. Inoltre, è diventato sempre più evidente che strutturalmentey neuroni simili possono esprimere diversi marcatori neurochimici e spettacolo corrispondenti differenze funzionali 4. Analogamente, neuroni con gli stessi marcatori neurochimici possono avere strutture e funzioni 5-10 distinte. Pertanto, in pratica, l'analisi delle caratteristiche funzionali dei neuroni e il loro ruolo nella rete comporta che definisce sia le identità morfologici e neurochimici. Anche con l'avvento di linee di topo giornalista targeting specifici marcatori neurochimici, spesso è necessario determinare la morfologia e all'identità sottotipo basato su immunoistologia 11.
Il metodo standard utilizzato per caratterizzare le cellule registrati in fettine di cervello acuto è di riempirli con biocitina o neurobiotin durante la registrazione, fissare le sezioni in paraformaldeide (PFA) seguendo le registrazioni, e utilizzare immunoistochimica per rivelare la morfologia e la neurochimica. Dal momento che lo spessore delle sezioni per fetta fisiologia sono in genere a 300 microno più, e perché la maggior parte degli anticorpi non riescono a penetrare fino in quella profondità, le fette devono essere ri-sezionato a 60 micron o meno per consentire immunostaining simultaneo per biocitina e marcatori neurochimici 12-14. Purtroppo, resezione è laboriosa; rischia la perdita di tessuto durante il sezionamento; e può portare a differenziale restringimento dei tessuti, complicando ricostruzioni morfologiche. Inoltre, la conoscenza preventiva della morfologia potrebbe aiutare a restringere i marcatori candidati che sono suscettibili di essere espressa dalle cellule. Abbiamo modificato i protocolli biocitina Immunoistologia standard per consentire l'elaborazione seriale sezioni prima per il recupero della morfologia e poi per l'identificazione di potenziali marcatori neurochimici.
Immunoistochimica è lo studio della distribuzione dell'antigene nei tessuti o cellule e possono essere visualizzati con un enzima, etichette fluorescenti, elementi radioattivi, o particelle colloidali in oro 15. La Proceduranvolves utilizzando anticorpi primari per etichettare specificamente e amplificare uno o più specifici antigeni, seguito dall'uso di anticorpi secondari fluorescenti rivolte l'anticorpo primario per la visualizzazione. A causa della necessità di distinguere gli spettri di fluorescenza di ciascun anticorpo secondario senza sovrapposizione, solo un numero limitato di antigeni può essere esaminato contemporaneamente. Così, la conoscenza preventiva della morfologia potrebbe essere utile nella scelta dei candidati marcatori neurochimici per la classificazione delle cellule. Concettualmente, la logica alla base di elaborazione di serie di sezioni già colorate si basa sulla premessa che immunomarcatura per una proteina o peptide non dovrebbe interferire con antigenicità e successiva immunomarcatura per un peptide strutturalmente indipendente 16. Questa mancanza di interferenza è dovuta al legame di anticorpi ad un specifico epitopo della proteina su un antigene e consente la colorazione simultanea di più antigeni nello stesso tessuto conseguenza. Il numero di antigeni Revealed mediante immunocolorazione è limitata dalla necessità di spettri non sovrapposizione degli anticorpi secondari fluorescenti e dalla necessità di indirizzare i singoli antigeni con anticorpi in specie diverse in modo da eliminare reattività crociata 17,18. Mentre questo è il ragionamento che sta dietro l'etichettatura di serie, piuttosto che simultaneamente con due anticorpi distinte che possono interagire, a nostra conoscenza, immunocolorazione per un secondo l'antigene non è stata riportata dopo il completamento del immunomarcatura per uno o più antigeni sulle sezioni montate. Qui, descriviamo un metodo per immunocolorazione serie di sezioni precedentemente colorate e montati. Mentre dettaglio questo processo per una procedura immunomarcatura seriale per il recupero della morfologia seguita dalla colorazione per i marcatori di proteine / peptidi in sezioni spesse, le stesse procedure possono essere utilizzati in serie, sottili sezioni istologiche pure. Inoltre, si descrive un approccio pratico per riempire neuroni registrati con biocitina e il processo per rimuovere laelettrodo dalla cella al termine di registrazioni per ottimizzare il riempimento del assonale e arbors dendritiche di neuroni, come presentato nel nostro recente 6,8 lavoro.
Il vantaggio più importante del procedimento qui descritto è che la morfologia della cellula registrato può essere completamente recuperato e ripreso prima di tentare di resezione o immunostain le fette. Anche se possono rendere necessario fette di resezione per immunostaining secondaria problemi con la penetrazione di alcuni anticorpi, le procedure descritte qui eliminerebbe la necessità di ricostruire i neuroni complessi da più sezioni e sarebbe evitare problemi dovuti alla perdita di tessuto ed il restringimento del differenziale, che possono compromettere la ricostruzione dopo resezione. Un ulteriore vantaggio è che il processo sarà ridurre i costi, tempo, fatica, e gli anticorpi costosi limitando immunoistochimica e ri-sezionamento a fette in cui vengono recuperati i neuroni biocitina-riempita. L'aspetto più pratico è la pubblicitàimmunostaining dizionale che può essere eseguita su sezioni colorate mesi prima di utilizzare la tecnica di cui sopra. In particolare, il recupero della morfologia ridurrebbe considerevolmente il potenziale che i dati fisiologici dalle cellule vengono scartati a causa dell'impossibilità di ottenere una caratterizzazione morfologica di base del tipo di cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
Riempire la cella patchato con biocitina è il passo più importante per garantire il pieno recupero della morfologia. Per il recupero completo della cella, è essenziale selezionare un orientamento ottimale fetta di minimizzare la rottura dei processi durante affettatura. Questo orientamento può variare in base al tipo di circuito e la cella in esame. Quindi, è essenziale per dare il tempo sufficiente per la biocitina di d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da NIH / NINDS R01 NS069861 e NJCBIR CBIR14IRG024 di VS.
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
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