神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色
Summary
このプロトコルは、ビオシチン充填およびその後の免疫組織化学的後処理を使用して電気生理学的記録の中にパッチを適用したニューロンの形態学的回復のための方法を提示しています。我々は、染色し、カバーガラスをした厚いビオシチン充填された部分は、後に第二次抗体日または数ヶ月で再染色することができることを示しています。
Abstract
パッチクランプ法を用いて細胞の電気生理学的記録は、発射パターンに基づいて、異なる神経形式の識別のために許可されています。記録電極におけるビオサイチン/ neurobiotinを含めることは、樹状樹枝状分岐し、記録ニューロンの軸索によって標的領域を決定するために必要な形態学的な詳細の事後の回復を可能にします。しかし、明確な神経化学的アイデンティティと機能を備えた形態学的に類似した神経細胞の存在を考えると、細胞型特異的タンパク質のための免疫組織化学的染色は、決定的に神経細胞を識別することが不可欠です。ネットワーク接続を維持するために、生理学的な記録のために脳切片を、300ミクロン以上の厚さで製造されます。しかし、この厚さは、多くの場合、組織の切除を必要とする、抗体の浸透の問題に起因する免疫組織学的後処理を妨げます。スライスの切除は、しばしばresul、挑戦的な芸術であります組織および細胞の形態の喪失ティン、そこから電気生理学的データが使用できないデータをレンダリングし、得られました。ニューロンマーカーの選択におけるデータ損失やガイドを制限する形態の回復以来、私たちは、二次免疫染色に続いて最初の細胞形態を回復する戦略を採用しています。私たちは、生理学的記録と神経化学的同一性を決定するためにセクションの再染色が続く形態の回復のためのその後のシリアル免疫染色、中に充填ビオサイチンする実用的なアプローチを紹介します。我々は、（PFA）パラホルムアルデヒドで固定し、染色し、そしてカバーガラスをビオシチンを充填したセクションは、削除され、2回目以降の一次抗体日で再染色することができると報告しています。この再染色は、カバースリップの除去、緩衝液中のセクションの洗浄、および神経化学的アイデンティティを明らかに一次および二次抗体のインキュベーションを必要とします。この方法は、DATを除去するために有利です。形態を回復し、形態学に基づいてテストされる神経化学的マーカーを絞ることができないことによる損失。
Introduction
脳は、その個々の神経要素の構造的および機能的特性の多様性のために知られています。脳機能と病理学の明確なニューロンタイプの役割を理解することは、特性評価および神経細胞の明確な同定を必要とします。軸索樹枝状のパターンが潜在的なシナプス後の標的を識別しながら、構造的に、SOMATO樹状の場所で定義された形態学的特徴は、与えられたニューロンが受ける潜在的な入力を決定します。ニューロンの構造的多様性は、ラモン・Yカハールの精液の組織学的研究1の時代から高く評価されています。単一細胞記録技術の出現は、構造的に異なるニューロンはまた、発火パターンおよびシナプスの特性の違いを示すことが明らかになりました。構造や生理機能の多様性は、GABA作動性抑制性ニューロン2,3に特に明らかです。また、structurallことがますます明らかになってきていますyの同様のニューロンは、異なる神経化学的マーカーを発現し、機能の違い4に対応する表示することができます。同様に、同じ神経化学的マーカーとニューロンは異なる構造と機能5-10を持つことができます 。したがって、実際には、ネットワーク内のニューロンの機能特性の解析とその役割は、両方の形態学的および神経化学的アイデンティティを定義することを伴います。さらには特定の神経化学的マーカーを標的レポーターマウス株の出現と、免疫組織学11に基づいて、形態およびサブタイプの同一性を決定することがしばしば必要です。
急性脳スライスに記録されている細胞を特徴付けるために使用される標準的な方法は、記録時のビオシチンまたはneurobiotinでそれらを埋める録音以下のパラホルムアルデヒド（PFA）でセクションを修正し、形態および神経化学を明らかにするために、免疫組織化学を使用することです。スライス生理学のためのセクションの厚さは、典型的には300μmであるので、以上、最も抗体は、その深さを介してすべての道を貫通しないので、そのスライスはビオサイチンと神経化学的マーカー12-14のための同時免疫染色を可能にするために、60μm以下に再区分する必要があります。残念ながら、切除は面倒です。切片中の組織のリスク損失。および形態学的再構成を複雑に、組織の収縮を差動につながることができます。さらに、形態学の予備知識は、細胞によって発現される可能性のある候補マーカーを絞り込む助けることができます。我々は最初の形態の回収のために、その後、潜在的な神経化学的マーカーの同定のためのセクションのシリアル処理を可能にするために、標準的なビオサイチン免疫組織学プロトコルを変更しました。
免疫組織化学は、組織または細胞中の抗原の分布の研究であり、酵素、蛍光標識、放射性元素、金コロイド粒子15を用いて可視化することができます。手続きの私具体的に可視化するための一次抗体を標的とする蛍光二次抗体の使用に続いて一つ以上の特定の抗原を、タグおよび増幅するために一次抗体を使用してnvolves。重複せず、それぞれの二次抗体の蛍光スペクトルを区別する必要性のために、抗原の唯一の限定された数を同時に検査することができます。従って、形態学の予備知識は、細胞分類の候補神経化学的マーカーを選択するのに有用であり得ます。概念的には、すでに染色切片のシリアル処理の背後にある論理的根拠は、1つのタンパク質またはペプチドを免疫標識することは構造的に独立したペプチド16のための抗原性及びその後の免疫標識を妨害してはならないことを前提としています。干渉の欠如は、抗原上の特定のタンパク質のエピトープに対する抗体の結合によるものであるため、同じ組織内の複数の抗原の同時染色を可能にします。抗原の数reveale免疫染色により、Dは、蛍光二次抗体の非重複スペクトルの必要性によって、および交差反応17,18を除去するように、異なる種において産生された抗体を用いて個々の抗原を標的とする必要性によって制限されます。これは、マウントされたセクション上の1つまたは複数の抗原のための免疫標識が完了した後に報告されていない第二の抗原に対する免疫染色、我々の知る限り、相互作用することができる二つの異なる抗体を用いたシリアルではなく、同時標識の背後にある理由は、ですが。ここでは、以前に染色し、取り付けられたセクションのシリアル免疫染色のための方法を説明します。私たちは詳細厚い部分でのタンパク質/ペプチドマーカーについて染色した形態の回復のためのシリアル免疫標識手順については、このプロセスをしながら、同様の手順は、薄い組織切片だけでなく、標準的に使用することができます。加えて、我々は取り除くために、ビオシチン、プロセスを記録したニューロンを埋めるための実践的なアプローチを説明します私たちの最近の研究6,8に示されるように、神経細胞の軸索と樹状突起アーバーの充填を最適化するために、録画の終了時にセルからの電極。
ここで説明する手順の最も重要な利点は、記録された細胞の形態が完全に切除またはスライス免疫染色しようとする前に回収して画像化することができるということです。ある種の抗体の浸透の問題は、二次免疫染色のために切除スライスにそれが必要なレンダリングかもしれないが、ここで詳述される手順は、複数のセクションから複雑なニューロンを再構築する必要がなくなると復興を損なうことができ、組織の損失と収縮差に起因する問題を回避するであろう切除以下。付加的な利点は、プロセスが免疫染色とビオシチンで満たされたニューロンが回収されたスライスに再切片を制限することによって、コスト、時間、労力、そして高価な抗体を削減することです。最も実用的な側面は、広告です上記の技術を使用する前に、染色切片ヶ月で行うことができditional免疫染色。具体的には、形態の回復はかなりの細胞からの生理学的データを伴う細胞型の基本的な形態学的特徴付けを得ることができないために廃棄されていることの可能性を減少させます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップ
ビオシチンでパッチを適用する細胞を充填することは形態の完全な回復を確実にするために最も重要なステップです。細胞の完全な回復のために、スライス中のプロセスの切断を最小限に抑えるために、最適なスライスの向きを選択することが重要です。この配向は検査中の回路および細胞タイプに基づいて異なる場合があ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、VSにNIH / NINDS R01 NS069861とNJCBIR CBIR14IRG024からの支援を感謝したいです
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCL | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
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