Farging av Biocytin fylte og Behandlet seksjoner nevrokjemiske Markers

Summary

Denne protokollen presenterer en metode for den morfologiske gjenvinning av nerveceller lappet under elektrofysiologiske opptak ved hjelp biocytin fylling og etterfølgende immunhistokjemisk postprosessering. Vi viser at tykke biocytin fylte seksjoner som var farget og coverslipped kan restained med en andre primære antistoff dager eller måneder senere.

Abstract

Elektrofysiologiske registreringer av celler ved bruk av plasteret klemmen teknikk har gjort det mulig for identifisering av forskjellige neuronale typer basert på avfyring mønstre. Inkludering av biocytin / neurobiotin i innspillingen elektrode tillater post-hoc utvinning av morfologiske detaljer som er nødvendige for å avgjøre dendrittiske arborization og regionene målrettet av aksonene av de registrerte nevroner. Imidlertid, gitt nærvær av morfologisk liknende nerveceller med forskjellige nevrokjemiske identiteter og funksjoner, immunohistokjemisk farging av celletypespesifikke proteiner som er nødvendig for å identifisere definitivt neuroner. For å opprettholde nettverkstilkoblingen blir hjerne seksjoner for fysiologiske opptak fremstilt ved en tykkelse på 300 um eller større. Men denne tykkelsen hindrer ofte immunhistokjemi postprosessering på grunn av problemer med antistoff penetrasjon, nødvendiggjør resectioning av vevet. Resectioning skiver er en utfordrende kunst, ofte Resulting i tap av vev og morfologien av cellene fra hvilke elektrofysiologiske data ble oppnådd, slik at dataene ubrukelig. Siden utvinning av morfologi ville begrense tap av data og veiledning i valg av nevrale markører, har vi vedtatt en strategi for å utvinne celle morfologi først, etterfulgt av sekundær immunfarging. Vi introduserer en praktisk tilnærming til biocytin fylling under fysiologiske opptak og etterfølgende serie farging for utvinning av morfologi, etterfulgt av restaining seksjoner å bestemme nevrokjemiske identitet. Vi rapporterer at deler som var fylt med biocytin, faste med Paraformaldehyde (PFA), farget, og coverslipped kan fjernes og restained med en andre primære antistoff dager senere. Dette restaining omfatter fjerning av dekkglass, vasking av seksjoner i en bufferoppløsning, og inkubering av primære og sekundære antistoffer for å vise nevrokjemiske identiteten. Fremgangsmåten er fordelaktig for å eliminere datet tap på grunn av en manglende evne til å gjenopprette morfologi og for innsnevring ned nevrokjemiske markører som skal testes basert på morfologi.

Introduction

Hjernen er kjent for diversitet i de strukturelle og funksjonelle karakteristika for de enkelte neuronale elementer. Forstå rollene til forskjellige nevronale typer i hjernens funksjon og patologi krever karakterisering og entydig identifisering av nerveceller. Strukturelt, de morfologiske funksjoner definert av somato-dendrittiske plassering bestemme mulige innganger som en gitt nevron mottar, mens mønsteret av aksonal arborization identifiserer potensielle postsynaptiske mål. Det strukturelle mangfoldet av nevroner har blitt verdsatt siden dagene av Ramón y Cajal banebryt histologiske undersøkelser ^1. Ankomsten av encellede opptak teknikker viste at strukturelt forskjellige neuroner viser også forskjeller i avfyringsmønster og synaptiske egenskaper. Mangfoldet i struktur og fysiologi er spesielt tydelig i gabaergic hemmende nerveceller ^2,3. I tillegg har det blitt stadig klarere at strukturelty lignende nevroner kan uttrykke ulike nevrokjemiske markører og viser tilsvarende funksjonelle ^fire forskjeller. På samme måte kan nerveceller med samme nevrokjemiske markører har forskjellige strukturer og funksjoner ^5-10. Således, i praksis, analysen av de funksjonelle egenskaper av nerveceller og deres rolle i nettverket medfører definerer både de morfologiske og neurokjemiske identiteter. Selv med bruk av reporter mus linjer rettet mot spesifikke nevrokjemiske markører, er det ofte nødvendig å bestemme morfologi og subtype identitet basert på immunohistologi ^11.

Standarden metode som brukes for å karakterisere cellene innspilt i akutte hjerneskiver er å fylle dem med biocytin eller neurobiotin under innspillingen, fikse delene i paraformaldehyde (PFA) etter opptakene, og bruke immunhistokjemi å avsløre morfologi og neurochemistry. Siden tykkelsen av seksjonene for skive fysiologi er omkring 300 umeller mer, og fordi de fleste antistoffer som ikke klarer å trenge inn i hele veien gjennom den dybde, skivene må re-seksjonert til 60 um eller mindre for å muliggjøre samtidig farging for biocytin og nevrokjemiske markører ^12-14. Dessverre er resectioning arbeidskrevende; risikerer tap av vev under seksjonering; og kan føre til differensial vev krymping, kompliserer morfologiske rekonstruksjoner. I tillegg kan forkunnskaper i morfologi å innskrenke søker markører som sannsynligvis vil bli uttrykt av cellene. Vi har modifisert standard biocytin immunohistologi protokoller for å tillate seriell behandling av delene først for gjenvinning av morfologi og deretter for identifisering av potensielle nevrokjemiske markører.

Immunhistokjemi er studiet av antigen fordeling i vev eller celler, og kan visualiseres ved hjelp av et enzym, fluorescerende markører, radioaktive elementer, eller gull kolloidpartikler ^15. Fremgangsmåten involves ved hjelp av primære antistoffer for spesifikt å merke og forsterke en eller flere spesifikke antigener, etterfulgt av anvendelse av fluorescerende sekundære antistoffer målrettet mot det primære antistoff for visualisering. På grunn av behovet for å skille den fluorescens-spektrene for hvert sekundært antistoff uten overlapping, kan bare et begrenset antall antigener undersøkes samtidig. Således kan forhåndskjennskap til morfologi være nyttige i å velge kandidatnevrokjemiske markører for celle klassifisering. Konseptuelt, er begrunnelsen bak serie behandling av allerede farget seksjoner basert på premisset om at immunolabeling for ett protein eller peptid bør ikke forstyrre antigenisitet og påfølgende immunolabeling for et strukturelt uavhengig peptid ^16. Denne mangel på interferens er på grunn av binding av antistoff mot et spesifikt protein epitop på et antigen, og derfor gjør det mulig for samtidig farging av multiple antigener i det samme vev. Antallet antigener revealed ved farging er begrenset av behovet for ikke-overlappende spektra av de fluorescerende sekundære antistoffer og av behovet for å målrette individuelle antigener med antistoffer dannet i forskjellige arter, slik som å eliminere kryssreaktivitet ^17,18. Selv om dette er begrunnelsen bak serie stedet for samtidig merking med to forskjellige antistoffer som kan samhandle, til vår kunnskap, farging for en andre antigen har ikke blitt rapportert etter ferdigstillelse av immunolabeling for ett eller flere antigener på monterte deler. Her beskriver vi en metode for serie farging av tidligere beiset og montert seksjoner. Selv om vi detalj denne prosessen for en seriell immunolabeling fremgangsmåte for utvinning av morfologi, etterfulgt av farging for protein / peptid markører i tykke seksjoner, kan samme fremgangsmåte anvendes i standard, tynne histologiske snitt i tillegg. I tillegg beskriver vi en praktisk tilnærming til å fylle registrerte nevroner med biocytin og prosessen for å løsneelektrode fra cellen ved gjennomføring av opptak for å optimalisere fylling av aksonal og dendrittiske arbors av neuroner, som presentert i vår siste arbeid ^6,8.

Det mest avgjørende fordel med fremgangsmåten som er beskrevet her er at morfologien til de registrerte celle kan være fullt gjenvinnes og avbildes før man forsøker å reseksjon eller immunfarging av skivene. Selv om problemer med inntrengning av visse antistoffer, kan gjøre det nødvendig å reseksjon skiver for sekundær immunofarging, vil prosedyrene som er beskrevet her eliminerer behovet for å rekonstruere komplekse nerveceller fra flere seksjoner og ville unngå problemer på grunn av vev tap og differensiert krymping, noe som kan kompromittere rekonstruksjon følgende resectioning. En ekstra fordel er at prosessen vil redusere kostnader, tid, krefter og dyre antistoffer ved å begrense farging og re-seksjonering til skiver der biocytin fylt nevroner utvinnes. Det mest praktiske aspektet er annonsennelle immunofarging som kan utføres på seksjonene farget måneder før bruk av den ovennevnte teknikk. Spesielt ville utvinning av morfologi betraktelig redusere potensialet som fysiologiske data fra cellene blir forkastet på grunn av en manglende evne til å oppnå en grunnleggende morfologisk karakterisering av celletype.

Protocol

1. Biocytin Fylling under Elektro MERK: Leserne kan referere til alternative kilder for grunnleggende patch-clamp opptak teknikker og instrumentering 19-22, som ikke er utdypet her. Trinnene er beskrevet her anta at utstyr og prosedyrer for patch-clamp opptakene er allerede etablert, og beskrivelsen vil være begrenset til detaljer knyttet til biocytin-fylling og post-hoc farging. Alle forsøk beskrevet i dette manuskriptet ble utført på rotter. Ved hjelp av en vibrat…

Representative Results

Etter fullført, seksjonene beholde biocytin fyll og den immunolabeling utført i trinn 2, og kan avbildes med confocal eller epifluorescence mikroskopi. I tillegg vil de behandlede seksjoner også viser immunofarging for antigenet merket i løpet av den etterfølgende behandling i trinn 3. I delen vist i figur 2, var morfologien til en biocytin fylt neuron i en tykk seksjon (300 um) viste ved hjelp av streptavidin visualisert i rødt og den første primære (CB 1</…

Discussion

Kritiske trinn i protokollen

Fylle lappet celle med biocytin er den mest avgjørende skritt for å sikre full gjenoppretting av morfologi. For full gjenoppretting av cellen, er det viktig å velge en optimal skive orientering for å redusere adskillelse av prosesser under kutting. Denne orienteringen kan variere basert på krets og celletypen under eksamen. Deretter er det viktig å gi tilstrekkelig tid for biocytin å diffundere til dendritter og aksoner. Noen fargestoffer,…

Materials

NaCl	Sigma	S7653	Immunostaining
KCL	Fluka	60129	Immunostaining
Na2HPO4	Sigma	S7907	Immunostaining
KH2PO4	Sigma	229806	Immunostaining
Triton X-100	Sigma	T8787	Immunostaining
Guinea pig anti CB1	Sigma	Af530-1	Immunostaining
Mouse anti CCK	CURE, UCLA	courtesy of G. Ohning	Immunostaining
Rabbit anti Parvalbumin	Swant	PV27	Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugate	Molecular Probes	S11227	Immunostaining
Normal goat serum	Sigma	G9023	Immunostaining
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Immunostaining
Secondary Antibodies	Invitogen Molecular probes	Alexa Fluor conjugated dyes	Immunostaining
Labnet orbit low speed shaker	Bioexpress	S-2030-LS	Immunostaining
Forceps	Dumont	11231-30	Immunostaining
Slide folders	EMS	71520	Immunostaining
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Electrophysiology
Multiclamp 700B amplifier	Molecular devices	Multiclamp 700B	Electrophysiology
pCLAMP 10 Software	Molecular devices	pCLAMP 10	Electrophysiology
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1440 digitizer	Electrophysiology
Filter tips	Nalgene	171-0020	Electrophysiology
Sonicator	Fisher Scientific	15-335-100	Electrophysiology
Microloaders	Eppendorf	930001007	Electrophysiology
Biocytin	Sigma	B4261	Electrophysiology